Ứng dụng kĩ thuật Metagenimics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây cà phê tại huyện Cưm'Gra tỉnh Đăk Lăk

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG

ỨNG DỤNG KĨ THUẬT METAGENIMICS TRONG NGHIÊN CỨU

HỆ VI SINH VẬT VÙNG RỄ CÂY CÀ PHÊ TẠI HUYỆN CƯM’GRA

TỈNH ĐĂK LĂK

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

HÀ NỘI, 2017

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự

hướng dẫn của TS. Phạm Bích Ngọc. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là

trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Huyền Trang

ii

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Phạm Bích Ngọc

đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt quá

trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn.

Xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Huyền Trang, Ths. Nguyễn Hồng Hà, Ths.

Nguyễn Khắc Hưng cùng tập thể cán bộ, nghiên cứu sinh, học viên phòng Công

nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và công

nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi

trong suốt thời gian thực hiện luận văn.

Xin chân thành cảm ơn đề tài : “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật

đất vùng rễ một số cây trồng ở Việt Nam: cây thuốc có củ (cây nghệ), cây công

nghiệp (cà phê) nhằm tăng năng suất và chất lượng cây trồng” do PGS. TS. Lê

Mai Hương chủ nhiệm đã hỗ trợ kinh phí và trang thiết bị trong quá trình thực

hiện luận văn.

Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô và ban đào tạo viện

Sinh thái và tài nguyên sinh vật đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong

suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Cuối cùng tôi xin cảm ơn đến bạn bè và gia đình đã giúp đỡ, chia sẻ,

động viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn.

Hà Nội, 1 tháng 11 năm 2017

Học viên

Hoàng Thị Huyền Trang

iii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU............................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 3

1.1. Cây cà phê và tình hình sản xuất cà phê .................................................... 3

1.1.1. Nguồn gốc,phân bố cây cà phê ............................................................... 3

1.1.2. Tình hình sản xuất cây cà phê tại Việt Nam....................................... 3

1.2. Hệ vi sinh vật đất và ý nghĩa đối với sinh trưởng, phát triển của cây trồng

........................................................................................................................... 5

1.2.1. Giới thiệu về hệ vi sinh vật ................................................................. 5

1.2.2. Vi sinh vật đất vùng rễ ........................................................................ 6

1.3. Công nghệ metagenomics và ứng dụng nghiên cứu đa dạng di truyền của

các hệ vi sinh vật đất ......................................................................................... 8

1.4. Các bước ứng dụng công nghệ Metagenomics trong nghiên cứu da dạng

khu hệ sinh vật từ môi trường ........................................................................... 9

1.5. Ứng dụng đọc trình tự gen thế hệ mới trong nghiên cứu metagenomics 14

1.5.1. Công nghệ đọc trình tự bán dẫn ion.................................................. 15

1.5.2. Công nghệ giải trình tự Illumina (Solexa) sequencing ..................... 17

1.6. Các nghiên cứu metagenomics trên thế giới và Việt Nam ...................... 21

1.6.1. Các nghiên cứu metagenomics trên thế giới..................................... 21

1.6.2. Các nghiên cứu metagenomics tại Việt Nam.................................... 22

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP.................................................... 25

2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 25

2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 25

2.2.1. Phương pháp thu mẫu....................................................................... 25

2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số............................................... 26

2.2.4. Khuếch đại vùng 16S rRNA ............................................................. 28

2.2.5. Tinh sạch sản phẩm PCR .................................................................. 29

2.2.6. Gắn Index (Nextera XT Index kit).................................................... 29

iv

2.2.7. Tinh sạch sản phẩm gắn Index.......................................................... 31

2.2.8. Đánh giá thư viện .............................................................................. 31

2.2.9. Biến tính thư viện và giải trình tự trên máy Miseq ........................ 31

2.2.10. Phân tích dữ liệu.......................................................................... 33

2.2.11. Phương pháp xác định tuyến trùng ............................................. 35

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................... 36

3.1. Phân tính đặc điểm lý hóa và sinh học chung của các mẫu ................ 36

3.2. Kết quả tách chiết DNA tổng số. ........................................................ 39

3.3. Chuẩn bị thư viện và gắn adapter........................................................ 40

3.4. Kết quả phân tích dữ liệu trình tự ....................................................... 41

3.5. Kết quả phân tích mức độ đa dạng quần thể vi khuẩn đất vùng rễ cây

cà phê ............................................................................................................. 42

3.5.1. Kết quả đánh giá độ đa dạng ở mức phân loại nghành .................. 43

3.5.2. Kết quả phân tích cấu trúc thành phần vi khuẩn chiếm ưu thế trong

đất vùng rễ ở mức độ phân loại lớp và họ vi khuẩn.................................... 44

3.5.3. Kết quả phân tích cấu trúc hệ vi khuẩn đất vùng rễ ở mức độ chi. 47

3.5.4. Kết quả phân tích thành phần một số loài vi khuẩn đặc trưng của hệ

vi sinh vật đất vùng rễ cây cà phê. .............................................................. 49

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 51

1. Kết luận ....................................................................................................... 51

2. Kiến nghị..................................................................................................... 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... 53

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Bảng thống kê thành phần hữu cơ của 4 mẫu đất nghiên cứu............ 38

Bảng 3.2. Nồng độ và độ tinh sạch 4 mẫu DNA tách từ đất............................... 40

Bảng 3.3: Thống kê dữ liệu trình tự thu được sau bước giải trình tự ................. 41

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Sơ đồ mô tả hoạt động của hệ thống giải trình tự của Illumina.......... 20

giai đoạn 1: tổng hợp........................................................................................... 20

Hình 1.2. Sơ đồ mô tả hoạt động của hệ thống giải trình tự của Illumina.......... 20

Hình 2.1. Vị trí tiến hành thu mẫu tại một khu vực nghiên cứu ......................... 26

Hình 2.2. Quy trình khuếch đại và giải trình tự vùng 16S rRNA....................... 28

Hình 2.3. Bố trí các ống mẫu .............................................................................. 30

Hình 2.4. Quy trình phân tích sử dụng công cụ QIIME ..................................... 34

Hình 3.1: Hình ảnh cây cà phê tái canh bệnh và cà phê kinh doanh tại khu vực

thu mẫu thí nghiệm. Cây cà phê tái canh bệnh (A) và mẫu rễ (C); Cây cà phê

kinh doanh (B) và mẫu rễ (D) ............................................................................. 36

Hình 3.2. Biểu đồ thể hiện thành phần loài tuyến trùng trong mẫu đất tại khu vực

nghiên cứu ........................................................................................................... 37

Hình 3.3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA tổng số ....................... 39

của 4 mẫuđất nghiên cứu..................................................................................... 39

Hình 3.4. Biểu đồ ghi lại tín hiệu đo kích thước sản phẩm khuếch đại bằng cặp

mồi 16S................................................................................................................ 40

Hình 3.4. Biểu đồ ghi lại tín hiệu đo kích thước sản phẩm gắn index................ 41

Hình 3.5: Rarefaction curve dựa trên dữ liệu trình tự của bốn hệ vi sinh vậtcác

OTU 0,1............................................................................................................... 42

Hình 3.6: Cấu trúc quần thể vi sinh vật ở mức độ ngành.................................... 43

Hình 3.7. Cấu trúc quần thể vi sinh vật ở mức độ lớp ........................................ 45