Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc Fusarium sp. trên thực vậ :Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường - Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm

BỘ CÔNG THƢƠNG

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU KHOA HỌCCẤP TRƢỜNG

Tên đề tài: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc

Fusarium sp. trên thực vật

Mã số đề tài: 19.2TP07SV

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Kim Huệ

Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm

Tp. Hồ Chí Minh, 2021

1

LỜI CẢM ƠN

Đề tài “Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc

Fusarium sp. trên thực vật” là nội dung chúng em chọn để thực hiện đề tài

nghiên cứu cấp trường của mình. Để thực hiện tốt đề tài nghiên cứu này, chúng

em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu, phòng Quản lí Khoa học và

Hợp tác Quốc tế trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo

một môi trường học tập và nghiên cứu thân thiện cũng như những hỗ trợ về mặt

kinh phí để cho chúng em phát huy khả năng nghiên cứu khoa học của mình.

Chúng em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo, Phòng Quản lý Phòng thí

nghiệm, và các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm đã luôn hỗ trợ,

giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở trang thiết bị cho chúng em trong quá

trình thực hiện đề tài nghiên cứu.

Chúng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Ngọc Ẩn. Cảm ơn

Thầy vì đã chỉ bảo, hướng dẫn em tận tình, cung cấp cho chúng em những kiến

thức sâu rộng trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu này.

Chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Phạm Tấn Việt, TS.

Nguyễn Thị Diệu Hạnh đã luôn cho em những lời khuyên, lời góp ý hữu ích,

giúp cho chúng em tích lũy thêm nhiều kiến thức, có cái nhìn sâu sắc hơn về các

vấn đề trong nghiên cứu cũng như trong cuộc sống, giúp chúng em hoàn thành

tốt nghiên cứu của mình.

Chúng em xin gửi lời cảm ơn ba mẹ vì đã luôn yêu thương, quan tâm chăm

sóc và tạo động lực tiếp bước cho con trên đường học vấn.

Chúng em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị, bạn bè trong tập thể Công

nghệ vi sinh đã ủng hộ, giúp đỡ chúng em trong suốt khoảng thời gian thực hiện

đề tài nghiên cứu này.

Mặc dù đã cố gắng hoàn thành nghiên cứu trong phạm vi cho phép nhưng

khả năng và kinh nghiệm của bản thân có hạn, nên bài nghiên cứu chắc chắn sẽ

không tránh khỏi những tồn tại, hạn chế và thiếu sót. Chúng em rất mong nhận

được sự thông cảm, góp ý và tận tình chỉ bảo của quý thầy cô và các bạn.

2

PHẦN I. THÔNG TIN CHUNG

I. Thông tin tổng quát

1.1. Tên đề tài: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm

mốc Fusarium sp. gây bệnh trên thực vật.

1.2. Mã số: 19.2TP07SV

1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

TT

Họ và tên

(học hàm, học vị) Đơn vị công tác

Vai trò thực hiện

đề tài

1

TS. Nguyễn Ngọc

Ẩn

Viện Công nghệ

Sinh học và Thực phẩm Cố vấn khoa học

2

Nguyễn Thị Kim

Huệ

ĐHSH13B, Viện Công nghệ

Sinh học và Thực phẩm Chủ nhiệm đề tài

3

Lê Thị Ngọc Ly

ĐHSH13B, Viện Công nghệ

Sinh học và Thực phẩm Chủ nhiệm đề tài

1.4. Đơn vị chủ trì: Viện Công nghệ Sinh học & Thực phẩm

1.5. Thời gian thực hiện:

1.5.1. Theo hợp đồng: từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 10 năm 2020

1.5.2. Gia hạn (nếu có): 06 tháng

1.5.3. Thực hiện thực tế: từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 4 năm 2021

1.6. Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Có

Bổ sung thêm thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế nấm mốc Fusarium sp.

bằng dịch nuôi cấy vi khuẩn với phương pháp trãi đĩa.

Bổ sung thêm thí nghiệm khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitinase của 5

chủng vi khuẩn đối kháng mạnh nhất.

1.7. Tổng kinh phí đƣợc phê duyệt của đề tài: 05 triệu đồng (bằng

chữ:

Năm triệu đồng).

3

II. Kết quả nghiên cứu

1. Đặt vấn đề

Người Việt coi trọng nghề nông, minh triết của người Việt coi nông nghiệp

là gốc của mọi thứ trong xã hội, „canh nông vi bản‟. Ngày nay nông nghiệp

không chỉ giúp ổn định cuộc sống cho phần lớn người nông dân Việt, mà còn là

nền tảng cho phát triển kinh tế-xã hội và ổn định chính trị, tạo tiền đề để hiện

thực hóa khát vọng công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước từ một quốc gia có

nền nông nghiệp còn chưa phát triển. Bên cạnh đó, Việt Nam nằm trong khu vực

khí hậu nhiệt đới gió mùa, mưa nhiều, độ ẩm cao, đất đai màu mỡ, nguồn nước

dồi dào và đa dạng sinh học là những điều kiện quan trọng để sau 40 năm “Đổi

mới” thực hiện cải cách kinh tế, ngành nông nghiệp Việt Nam đã phát triển theo

hướng thương mại đa dạng, đáp ứng nhu cầu trong nước và thế giới.

Những năm gần đây ngành nông nghiệp nước ta đã đạt được những thành

tựu to lớn. Từ một đất nước từng bị nạn đói đe dọa, Việt Nam hiện đứng thứ 2 ở

Đông Nam Á và thứ 15 trên toàn cầu về xuất khẩu nông sản [1]. Kim ngạch xuất

khẩu nông sản tăng vọt từ 4,2 tỷ đô la Mỹ năm 2004 [2] lên 41,3 tỷ đô la Mỹ năm

2019, chiếm 15,68% tổng kim ngạch xuất khẩu quốc gia [3]. Các nông sản xuất

khẩu hàng đầu của Việt Nam là gạo, cà phê, hạt tiêu, chè, hạt điều, cao su, sắn,

thủy sản,… [4]. Thị trường xuất khẩu nông sản của Việt Nam chủ yếu là Trung

Quốc, Châu Âu, Mỹ, ASEAN, Nhật Bản và Hàn Quốc [5]. Tuy nhiên, trước tác

động của biến đổi khí hậu và xu thế cạnh tranh của nền kinh tế thị trường, ngành

nông nghiệp Việt Nam cũng gặp không ít khó khăn vì thiên tai, dịch hại do sâu

bệnh, nấm bệnh, … đã làm giảm năng suất và chất lượng nông sản.

Hiện nay, nấm bệnh xuất hiện ngày càng nhiều ở cây công nghiệp và gây ra

những tổn thất to lớn cho sản xuất nông nghiệp. Tính đến năm 2005, thì có

khoảng 14% các khoản thiệt hại trên thế giới hoàn toàn là từ các bệnh hại cây

trồng gây ra, và hơn 50% các bệnh hại cây trồng là do nấm gây ra với hàng tỷ

Euro thiệt hại mỗi năm (Agrios, 2005). Ở Việt Nam, các bệnh do Fusarium sp.

gây ra là vấn đề quan trọng (gây thối dưa hấu, thối củ khoai tây, thối bắp, thối

các cây họ đậu...). Vì thế các loài nấm Fusarium sp. đã được nghiên cứu từ

khoảng đầu thế kỷ XIX. Đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về

4

nấm Fusarium sp. đã được công bố và có ý nghĩa lớn trong sự phát triển của

khoa học kỹ thuật. Một số công trình nghiên cứu như:

- Theo Binder và Hutchinson (1959) cà chua bị bệnh héo vàng do

nấm Fusarium sp. sẽ chết nhanh và thiệt hại lớn khi cùng bị tuyến

trùng (Meloidogine incognita) xâm nhập vì tuyến trùng làm giảm tính chống

bệnh của cà chua đối với nấm Fusarium sp..

- Theo Nguyễn Văn Viên (1997) cho biết vụ đông xuân 1994 ở Tiên Dương

– Đông Anh tỷ lệ cây nhiễm bệnh héo vàng trung bình 4.0%, cà chua trồng trên

đất phèn tỷ lệ cây nhiễm bệnh là 5.8%, ở chân đất cao tỷ lệ cây nhiễm bệnh là

2.2%. Trên môi trường PDA thuốc Benlate 0.1% có tác dụng ức chế sự phát triển

của tản nấm Fusarium oxysporum.

Tuy nhiên, những công trình nghiên cứu nấm mốc Fusarium sp. vẫn chưa

được ứng dụng rộng rãi và chưa đưa lại hiệu quả cao. Vì người nông dân thường

sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong nông nghiệp gây ảnh

hưởng tiêu cực đến môi trường, dẫn đến mất cân bằng trong quần thể vi sinh vật

đất có ích, tạo môi trường bất lợi đối với các sinh vật có ích phát triển, và tạo

điều kiện để nấm bệnh, các loài côn trùng có hại kháng thuốc hơn, đồng thời

cũng tiêu diệt các loài thiên địch có ích.

Chính vì vậy, để hạn chế tác hại của dịch bệnh và đảm bảo an toàn cho hệ

sinh thái, môi trường và sức khỏe con người thì việc nghiên cứu tạo ra các sản

phẩm có nguồn gốc sinh học là rất cần thiết. Hiện nay đã có một số công trình

nghiên cứu vi sinh vật có lợi để tiêu diệt bệnh hại ở cây, sử dụng vi khuẩn ức chế

nấm gây bệnh là một trong các hướng nghiên cứu mới góp phần bảo vệ năng suất

cây trồng và thân thiện với môi trường. Vi khuẩn có nhiều tiềm năng vì sự phong

phú, đa dạng và phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có khả năng sản sinh các chất

kháng nấm mạnh và đó cũng là lý do chúng tôi lựa chọn đề tài nghiên cứu:

“Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc Fusarium sp. trên

thực vật”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm

mốc Fusarium sp. trên thực vật.

3. Nội dung nghiên cứu

5

 Phân lập các chủng vi khuẩn từ các nguồn khác nhau.

 Xác định khả năng đối kháng nấm mốc Fusarium sp. gây bệnh của các

chủng vi sinh vật phân lập được và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính

đối kháng mạnh nhất với nấm mốc Fusarium sp..

 Khảo sát đặc điểm kháng mốc Fusarium sp. của vi khuẩn trên sự nảy

mầm và hệ sợi tơ nấm.

4. Phƣơng pháp nghiên cứu

4.1. Phương pháp lấy mẫu

 Chọn điểm thu mẫu đất: các mẫu đất được lấy ở những khu vực khác

nhau (đất gò cao, khu vực có nhiều gỗ cây bị hoai mục, đất khu vực ẩm ướt, bờ

ruộng, khu vực xung quanh chuồng gà, chuồng lợn, …) thuộc 2 tỉnh Bình Dương

và Thành phố Hồ Chí Minh.

 Cách lấy mẫu: dùng dao lấy khoảng 10-15 g đất ở độ sâu 10-15 cm ở các

vị trí trên, cho vào túi nylon đã khử trùng, buộc kín, ghi ngày và vị trí lấy mẫu.

Mẫu đất được bảo quản ở 4

°C, sau 2 ngày tiến hành phân lập vi khuẩn [6].

4.2. Phân lập vi khuẩn từ đất [7]

Cân 1 g đất cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng (hoặc nước

muối sinh lý), mix đều trên máy Vortex.

Tiến hành pha loãng thập phân: dùng pipette vô trùng hút 1 ml dịch đất sang

ống nghiệm có chứa 9 ml nước vô trùng và tiếp tục pha loãng đến nồng độ thích

hợp.

Chọn 3 nồng độ pha loãng liên tiếp 10-3

đến 10-5

, hút 0.1 ml chuyển sang đĩa

petri chứa môi trường LB agar. Dùng que trang trải đều, đậy đĩa petri, gói lại rồi

lật sấp và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 30 trong 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc đặc

trưng, cấy chuyền bằng phương pháp cấy ria cho đến khi có chủng vi khuẩn

thuần khiết. Tiến hành quan sát và phân biệt khuẩn lạc vi khuẩn với các loại vi

sinh vật khác.

Các chủng vi khuẩn phân lập được giữ giống trong Glycerol 50% ở -80 .

4.3. Quan sát đặc điểm hình thái của vi khuẩn

Quan sát đại thể: Vi khuẩn được cấy ria trên môi trường Luria Bertani (LB),

ủ ở nhiệt độ phòng, quan sát các đặc điểm về đại thể sau 2 ngày nuôi cấy (kích

thước, hình dạng, đặc điểm của bề mặt, rìa, màu sắc khuẩn lạc mặt trên, mặt dưới).

6

Quan sát vi thể: Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường LB theo phương

pháp nhuộm Gram, nhuộm bào tử và quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ

phóng đại 1000 lần [7].

4.4. Sàng lọc, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm

mốc

Fusarium sp.

Nguyên tắc: Hoạt tính đối kháng của dịch nuôi cấy vi khuẩn đối với nấm

Fusarium oxysporum được thể hiện thông qua khả năng ức chế sự lan tơ của nấm

bệnh tạo nên vùng ức chế.

Cách tiến hành: Nuôi cấy vi khuẩn trong 5 ml môi trường LB broth, lắc 150

vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng và thu nhận dịch nuôi cấy. Sau đó, nấm

Fusarium sp. (đường kính d=5 mm) được cấy lên đĩa thạch Potato Glucose Agar

(PGA) (cách mép đĩa petri 4 cm) trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng. Nhỏ 5 µl dịch vi

khuẩn vào môi trường PGA đã cấy nấm bệnh vào phía đối diện vị trí cấy nấm.

Để ở nhiệt độ phòng, sau 3 ngày tiến hành kiểm tra kết quả dựa vào kích thước

vòng đối kháng [8].

Tỷ lệ phần trăm khả năng vi khuẩn ức chế sự phát triển của nấm Fusarium

sp. (PIRG) được tính như sau [9]:

PIRG =

x 100

R1: trung bình độ lan của hệ sợi tơ nấm ở đĩa đối chứng.

R2: trung bình độ lan của hệ sợi tơ nấm khi nuôi cấy chung với vi khuẩn.

Thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần.

4.5. Phương pháp khảo sát sự ảnh hưởng của vi khuẩn lên sự nảy mầm của

bào tử và sự phát triển của hệ sợi tơ nấm Fusarium sp. [10]

Dịch vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường LB broth ở 24 giờ, nhiệt độ phòng

sẽ được ly tâm tốc độ 13,000 rpm ở 4°C trong 10 phút. Lọc qua màng lọc với

kích thước lỗ lọc là 0,22 µm để loại bỏ bào tử vi khuẩn.

Khảo sát sự tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên bào tử nấm Fusarium

oxysporum: Nấm F. oxysporum sau 5 ngày cấy trên môi trường PGA sẽ được thu

nhận bào tử bằng PGB. Que cấy vô trùng được sử dụng với mục đích giúp bào

tử thoát ra khỏi hệ sợi tơ. Phần dịch huyền phù được thu nhận và ly tâm với tốc

7

độ 5,000 rpm ở 4°C trong 5 phút, thu nhận phần dịch nổi chứa bào tử mốc. Dịch

bào tử nấm F. oxysporum với mật độ 106

bào tử/ml sẽ được ủ với dịch vi khuẩn,

trong đó lô đối chứng là bào tử nấm F. oxysporum sẽ được ủ với môi trường LB

broth. Quan sát sự phát triển của bào tử nấm F. oxysporum ở 2 nghiệm thức từ 0-

24 giờ dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000X. Sau đó tiến hành

đánh giá khả năng tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn lên sự nảy mầm của bào

tử nấm Đồng thời cấy trải dịch lên môi trường PGA ủ 48 giờ ở nhiệt độ phòng

để xác định số lượng khuẩn lạc nấm mốc phát triển của mẫu có trộn dịch vi

khuẩn so với đối chứng.

4.6. Phương pháp định danh vi khuẩn

Mẫu vi khuẩn được gửi đến Công ty Trách nhiệm hữu hạn Nam Khoa để

giải trình tự. Sau khi có trình tự gene của chủng vi khuẩn nghiên cứu, tiến hành

xây dựng cây phát sinh loài bằng cách so sánh với các trình tự gene tương đồng

trên ngân hàng dữ liệu NCBI. Sắp giống trình tự gene của chủng vi khuẩn nghiên

cứu với các trình tự gene tương đồng trên ngân hàng dữ liệu. Cây phát sinh loài

được xây dựng dựa trên thuật toán Neighbor-Joining với bootstrap 1000 lần lặp

lại bằng phần mềm Mega phiên bản 5.0.

4.7. Khảo sát khả năng sinh chitinase ngoại bào của vi khuẩn

Nguyên tắc: Chitin sẽ bị phân hủy thành N-acetyl glucosamine khi có sự

hiện diện của chitinase. N-acetyl glucosamine có cấu trúc mạch ngắn hơn chitin

nên không bắt màu với thuốc thử Lugol. Xác định hoạt tính chitinase thông qua

kích thước vòng phân giải (vùng không bắt màu với Lugol).

Cách tiến hành: Cấy chấm điểm vi khuẩn trên môi trường LB chitin. Tiến

hành xác định hoạt tính chitinase sau 2 ngày cấy bằng cách đo vòng phân giải

chitin sau khi nhuộm thuốc thử Lugol [11], [12].

4.8. Phương pháp xử lí số liệu

Sử dụng phần mềm Excel để tổng hợp tính toán các số liệu từ kết quả thu

nhận được trong quá trình thực hiện thí nghiệm.

Sử dụng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) bằng phần mềm

thống kê Statgraphic phiên bản 15.1 để đánh giá sự khác biệt giữa yếu tố và điều

kiện khảo sát.

5. Tổng kết về kết quả nghiên cứu