Tổng hợp và xác định hoạt tính chống oxy hóa của các Tryptophyllin L peptide bằng phương pháp mô hình thống kê định lượng 3DQSAR kết hợp với thực nghiệm in vitro :Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu Khoa học cấp Trường

i

BỘ CÔNG THƯƠNG

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

Tên đề tài

Tổng hợp và xác định hoạt tính chống oxy hóa của các Tryptophyllin

L peptide bằng phương pháp mô hình thống kê định lượng 3D￾QSAR kết hợp với thực nghiệm in vitro

Mã số đề tài: 21/1H03

Chủ nhiệm đề tài: TS. TRẦN THỊ THANH NHÃ

Đơn vị thực hiện: KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH, 11.2021

Tp. Hồ Chí Minh, ........…

ii

MỤC LỤC

MỤC LỤC..............................................................................................................................II

DANH MỤC HÌNH ẢNH................................................................................................... III

DANH MỤC BẢNG.............................................................................................................. V

DANH MỤC PHỤ LỤC ......................................................................................................VI

LỜI CÁM ƠN.........................................................................................................................1

PHẦN I. THÔNG TIN CHUNG...........................................................................................2

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN........................................................................................9

1.1. Tổng quan vấn đề nghiên cứu........................................................................................9

1.2. Hiện trạng các công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài. .....................................10

1.2.1. Tình hình nghiên cứu quốc tế................................................................................10

1.2.2. Tình nghiên cứu trong nước:.................................................................................11

1.2.3. Đánh giá kết quả các công trình nghiên cứu đã công bố ......................................11

1.3. Mô hình mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc và hoạt tính của các hợp chất

(quantitative structure-activity relationship: QSAR). .....................................................12

1.3.1. Phương pháp So Sánh Trường Phân Tử (Comparative Molecular Field Analysis,

CoMFA) ...............................................................................................................12

1.3.2. Phương pháp So Sánh Chỉ Số Tương Tự Phân Tử (Comparative Molecular

Similarity Indices Analysis, CoMSIA). ...............................................................15

1.4. Tổng hợp hữu cơ trên chất mang pha rắn sử dụng kỹ thuật Fmoc.........................15

1.4.1. Chất nền (resin) và các nhóm liên kết (linker).....................................................17

1.4.2. Các nhóm bảo vệ ..................................................................................................18

1.4.3. Tác nhân hoạt hóa.................................................................................................20

CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP......................................................22

2.1. Phương pháp tính toán.................................................................................................22

2.1.1. Nguồn dữ liệu, tối ưu hóa cấu trúc và xếp chồng phân tử. ...................................22

2.1.2. Mô hình Trường lực và mô hình Gaussian 3D-QSAR .........................................23

2.1.3. Thẩm định mô hình ...............................................................................................24

2.2. Thực nghiệm..................................................................................................................25

2.2.1. Vật liệu ..................................................................................................................25

2.2.2. Phương pháp thực nghiệm.....................................................................................25

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................27

3.1. Mô hình Trường lực và mô hình Gaussian ................................................................27

3.2. Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của 5 peptide tổng hợp ......................................31

3.2.1. Peptide Pro-Trp-Tyr (P-W-Y)...............................................................................32

3.2.2. Peptide Pro-Trp-Tyr(NH2) (P-W-Y(NH2)) ...........................................................34

3.2.3. Peptide Pro -Tyr-Trp (P -Y-W).............................................................................36

3.2.4. Peptide Pro -Tyr-Trp(NH2) (P -Y-W(NH2)) .........................................................38

3.2.5. Peptide Leu-Pro-Trp-Tyr(NH2) (L-P-W-Y (NH2): tryptophyllin L 4.1) ..............40

3.3. Hoạt động bắt gốc tự do ABTS+.

..................................................................................42

3.4. Phản ứng khử sắt ..........................................................................................................45

CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................49

iii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1. Minh họa trường tương tác phân tử tại một điểm nút của mạng lưới.......................12

Hình 2. Quy trình xây dựng mô hình trường phân tử 3D-QSAR CoMFA............................14

Hình 3. Quy trình tổng hợp peptide trong pha rắn.................................................................16

Hình 4. Các liên kết linker thường được sử dụng..................................................................18

Hình 5. Hệ bảo vệ Fmoc/tBu .................................................................................................19

Hình 6. Sự phân tách của nhóm Boc......................................................................................19

Hình 7. Sự phân tách của nhóm Fmoc...................................................................................19

Hình 8. Phản ứng giữa nhóm amine và acid carboxylic được hoạt hóa. ...............................20

Hình 9. Xếp chồng a) 108 peptide từ bộ dữ liệu TEAC và b) 16 tryptophyllin L và hai

tripeptide mới được thiết kế. ..........................................................................................23

Hình 10. Đồ thị tương quan hoạt tính từ thực nghiệm và dự đoán của các tập huấn luyện và

tập kiểm tra rút ra từ mô hình a), b) Trường lực và c), d) Gaussian. .............................28

Hình 11. Bản đồ biên dạng (contour) của năm trường bắt nguồn từ mô hình Trường lực. (a)

trường không gian (dương: xanh lục, âm: vàng); (b) Trường tương tác tĩnh điện (xanh

lam: dương; đỏ: âm). ......................................................................................................29

Hình 12. Bản đồ đường biên dạng của năm trường bắt nguồn từ mô hình Gaussian: (a)

trường không gian (dương: xanh lục, âm: vàng); (b) trường tương tác tĩnh điện (xanh

lam: dương; đỏ: âm); (c) trường kỵ nước (cam: dương, trắng: âm), (d) trường chất nhận

liên kết hydro (xanh lục: dương; hồng tươi: âm); (e) trường cho liên kết hydro (tím:

dương; xanh lam: âm).....................................................................................................30

Hình 13. Cấu trúc của peptide P-W-Y...................................................................................32

Hình 14. Phổ khối dương [M+H]+

của peptide P-W-Y. ........................................................33

Hình 15. Phổ HPLC của peptide P-W-Y. ..............................................................................33

Hình 16. Phổ khối dương +ESI MS/MS của peptide P-W-Y................................................34

Hình 17. Cấu trúc của peptide P-W-Y(NH2).........................................................................34

Hình 18. Khối phổ dương [M+H]+

của peptide P-W-Y(NH2)...............................................35

Hình 19. Phổ HPLC của peptide P-W-Y(NH2). ....................................................................36

Hình 20. Phổ khối dương +ESI MS/MS của peptide P-W-Y(NH2)......................................36

Hình 21. Cấu trúc của peptide P -Y-W..................................................................................36

Hình 22. Phổ khối dương [M+H]+ của peptide P-Y-W. ........................................................37

Hình 23. Phổ HPLC của peptide P-Y -W. .............................................................................37

Hình 24. Phổ khối dương +ESI MS/MS của peptide P- Y-W...............................................38

Hình 25. Cấu trúc của peptide P -Y-W(NH2)........................................................................38

Hình 26. Phổ khối dương [M+H]+

của peptide P-Y-W(NH2). ..............................................39

Hình 27. Phổ HPLC của peptide P-Y-W(NH2). ....................................................................39

Hình 28. Phổ khối dương +ESI MS/MS của peptide P- Y-W(NH2).....................................40

Hình 29. Cấu trúc của peptide L-P-W-Y (NH2) (tryptophyllin L 4.1) ..................................40

Hình 30. Khối phổ dương [M+H]+

của peptide L-P-W-Y(NH2)...........................................41

Hình 31. Phổ HPLC của peptide L-P-W-Y(NH2)..................................................................41

Hình 32. Phổ khối dương +ESI MS/MS của peptide L-P-W-Y(NH2) ..................................42

iv

Hình 33. Giá trị bắt gốc ABTS+. tương đương trolox của 5 peptide tại nồng độ 8,2 M và

thời gian 6 phút...............................................................................................................42

Hình 34. Tốc độ phản ứng bắt cation gốc 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic

acid) (ABTS˙ +) của các peptide tại các nồng độ (a) 2,5 M và (b) 10 M..................44

Hình 35. TEAC của 5 peptide và glutathione trong khoảng nồng độ từ 2,5 đến 10 M.......45

Hình 36. Hoạt tính khử sắt của các tryptophyllin L peptide và Trolox ở nồng độ 25 M tại

30 phút. ...........................................................................................................................46

Hình 37. Sự thay đổi khả năng khử sắt của các peptide theo thời gian ở ba nồng độ khác

nhau a) 25, b) 50 và c) 100 M. .....................................................................................48

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Năm peptide Tryptophyllin L và dẫn xuất đã được tổng hợp trong nghiên cứu........4

Bảng 2. Các Tryptophyllin L peptide được phân lập từ loài ếch Litoria rubella [16, 18]. .....9

Bảng 3. Dữ liệu của bộ tập huấn mô hình và bộ thử nghiệm mô hình. .................................22

Bảng 4. Các thông số thống kê của mô hình Trường lực (4 biến số chính) và mô hình

Gaussian (5 biến số chính). ............................................................................................27

Bảng 5. Đóng góp của các trường vào mô hình Trường lực (4 biến số chính) và mô hình

Gaussian (5 biến số chính). ............................................................................................28

Bảng 6. Các giá trị TEAC được dự đoán từ mô hình Trường lực và mô hình Gaussian. .....31

Bảng 7. Bảng phân tích phổ khối và HPLC của 5 peptide được tổng hợp............................31

vi

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Thiết bị thủy tinh dùng trong tổng hợp peptide ....................................................54

Phụ lục 2. Điều kiện và thời gian lưu HPLC của sản phẩm tổng hợp PWY. ........................55

Phụ lục 3 Điều kiện và thời gian lưu HPLC của sản phẩm tổng hợp PWY(NH2). ...............56

Phụ lục 4. Điều kiện và thời gian lưu HPLC của sản phẩm tổng hợp PYW. ........................57

Phụ lục 5. Điều kiện và thời gian lưu HPLC của sản phẩm tổng hợp PYW(NH2). ..............58

Phụ lục 6. Điều kiện và thời gian lưu HPLC của sản phẩm tổng hợp LPWY (NH2)............59

vii

DANH MỤC VIẾT TẮT

3D-QSAR: three dimensional quantitative structure activity relationship- mô hình 3 chiều

định lượng quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học

ABTS: 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid

Boc: t-butoxycarbonyl

Bzl: benzyl

BHA: butylhydroxyanisole

BHT: butylated hydroxytoluene

COMFA: Comparative molecular field analysis

COMSIA: Comparative Molecular Similarity Indices Analysis

CNN: convolutional neural networks- mạng thần kinh nơ-ron tích tụ

DCM: dichloromethane

DMF: dimethylformamide

DPPH: 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl-hydrate

FRAP: ferric reducing antioxidant power- khả năng chống oxi hóa thể hiện qua khả năng

khử sắt

Fmoc: fluorenylmethyloxycarbonyl

HATU: 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxide

hexafluorophosphate, Hexafluorophosphate Azabenzotriazole Tetramethyl Uronium

HBTU: 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate,

Hexafluorophosphate Benzotriazole Tetramethyl Uronium

HPLC: high performance liquid chromatography- sắc ký lỏng hiệu năng cao

IC50: half maximal inhibitory concentration- nồng độ ức chế tối đa 50% một quá trình sinh

học

MLR: multiple linear regression- hồi quy tuyến tính đa biến

PLS: partial least square- bình phương tối thiểu một phần

PyBroP

RF: random forest- rừng ngẫu nhiên

SPPS: Solid phase peptide synthesis- tổng hợp peptide trên pha rắn

SVM: support vector machine- máy vectơ hỗ trợ

tBu: tert-bytyl

TEAC: trolox equivalent antioxidant capacity

TFA: trifluoroacetic acid

TPTZ: 2,4,6-tripyridyl-s-triazine

1

LỜI CÁM ƠN

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ nghiên cứu khoa học của IUH, Ban lãnh đạo IUH,

Lãnh đạo khoa Công nghệ Hóa học, Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Hóa học, các thành

viên của đề tài đã giúp tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này. Cảm ơn các thành viên

nhóm nghiên cứu: TS. Trần Thị Diệu Thuần, TS. Trần Đình Phiên thuộc Trung tâm nhiệt đới

Việt Nga và GS. TS. John Hamilton Bowie thuộc Trường Đại học Adelaide, đã đóng góp ý

kiến và ủng hộ tinh thần để tôi để hoàn thành công trình nghiên cứu này.

2

PHẦN I. THÔNG TIN CHUNG

I. Thông tin tổng quát

1.1. Tên đề tài: Tổng hợp và xác định hoạt tính chống oxy hóa của các Tryptophyllin L

peptide bằng phương pháp mô hình thống kê định lượng 3D-QSAR kết hợp với thực

nghiệm in vitro.

1.2. Mã số: 21/1H03

1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

TT

Họ và tên

(học hàm, học vị)

Đơn vị công tác Vai trò thực hiện đề tài

1 TS. Trần Thị Thanh Nhã Khoa Công nghệ hóa học Chủ nhiệm

2 TS. Trần Thị Diệu Thuần Khoa Công nghệ hóa học Thành viên

1.4. Đơn vị chủ trì: Khoa Công nghệ Hóa học, Đại học Công nghiệp Tp.HCM

1.5. Thời gian thực hiện:

1.5.1. Theo hợp đồng: từ tháng 03 năm 2021 đến tháng 02 năm 2022.

1.5.2. Gia hạn (nếu có): Không

1.5.3. Thực hiện thực tế: từ tháng 03 năm 2020 đến tháng 11 năm 2020

1.6. Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):

1.7. Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 55 triệu đồng.

II. Kết quả nghiên cứu

1. Đặt vấn đề

Vai trò của peptide ngày càng trở nên quan trong trong các ngành công nghiệp và nghiên cứu

của hóa dược, hóa mỹ phẩm và gần đây là công nghệ thực phẩm [1-4]. Các công trình nghiên

cứu cho thấy, các peptide phân lập từ tự nhiên thể hiện đa dạng các hoạt tính sinh học bao

gồm khả năng chống oxy hóa, chống tăng huyết áp, kháng vi sinh…[5, 6]. Peptide chống oxy

hóa đặc biệt được chú ý khi chúng góp phần quan trọng vào việc ngăn ngừa và chữa trị các

căn bệnh như tim mạch, tiểu đường, ung thư và viêm khớp [7-9].

3

Việc khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các peptide tách chiết từ tự nhiên cùng với việc

nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố cấu trúc đến khả năng chống oxy hóa của các chúng sẽ

góp phần mở rộng ngân hàng các peptide thuộc nhóm này, đồng thời làm cơ sở cho việc dự

đoán và thiết kế peptide ứng dụng trong các ngành như công nghệ thực phẩm và dược phẩm

[10, 11]. Chính vì mục đích này mà trong nghiên cứu này, nhóm tiến hành sàng lọc tất cả các

peptide tryptophyllin L đã được phân lập từ loài ếch Litoria rubella sử dụng mô hình ba chiều

định lượng mối quan hệ hoạt tính và cấu trúc (3D-QSAR: three dimensional quantitative

structure activity relationship) dựa trên phương pháp CoMFA (Comparative Molecular Field

Analysis) và CoMSIA (Comparative Molecular Similarity Indices Analysis). Các peptide với

dự đoán có giá trị bắt gốc tương đương trolox (trolox equivalent antioxidant capacity: TEAC)

lớn nhất sẽ được tổng hợp trên pha rắn bằng phương pháp Fmoc và xác định hoạt tính chống

oxy hóa thực nghiệm in vitro.

2. Mục tiêu

2.1. Mục tiêu tổng quát:

Sử dụng phương pháp thống kê định lượng 3D-QSAR nhằm dự đoán và sàng lọc các

peptide Tryptophyllin L và dẫn xuất có hoạt tính chống oxi hóa cao. Tổng hợp các peptide

này sử dụng phương pháp tổng hợp trên pha rắn và thử nghiệm và đối chiếu hoạt tính sử

dụng các thí nghiệm bắt gốc tự do. Từ đó, đề xuất các đặc điểm cấu trúc ảnh hưởng tích

đến hoạt tính chống oxi hóa của các peptide này, đồng thời đề xuất cấu trúc nền có thể

tiến hành nghiên cứu và ứng dụng xa hơn trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm.

2.2. Mục tiêu cụ thể:

 Xây dựng mô hình 3D-QSAR CoMSIA về hoạt tính chống oxi hóa của hệ data của các

tripeptide. Sử dụng mô hình này để dự đoán và phân tích mối liên hệ giữa cấu trúc và

hoạt tính chống oxi hóa của các Tryptophyllin L tripeptide và dẫn xuất.

 Tổng hợp trên pha rắn 5 Tryptophyllin peptide và dẫn xuất sử dụng kỹ thuật tổng hợp

Fmoc.

 Tinh chế petide bằng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo, xác minh cấu trúc của chúng

bằng phổ khối (MS) và nuclear magnetic resornance (NMR).

4

 Xác định hoạt tính chống oxy hóa của chúng qua các thí nghiệm bắt gốc FRAP (ferric

reducing antioxidant power) và ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic

acid).

 Viết và công bố 01 bài công quốc tế SCI hoặc SCIE.

 Báo cáo tổng kết và nghiệm thu.

3. Phương pháp nghiên cứu

Kết hợp phương pháp thống kê toán học dựa trên trường tương tác phân tử CoMFA và

CoMSIA với tổng hợp hữu cơ trên pha rắn và thực nghiệm in vitro.

 Tổng quan tài liệu, thiết kế thực nghiệm và xây dựng kế hoạch thực nghiệm;

 Tổng hợp peptide trên pha rắn sử dụng kỹ thuật Fmoc;

 Tinh chế petide bằng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo, xác minh cấu trúc của chúng

bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và phổ khối (MS);

 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa sử dụng hai thí nghiệm:

+ Xác định khả năng bắt gốc tự do ABTS.

+ Xác định khả năng khử sắt (FRAP)

 Đánh giá các kết quả nghiên cứu;

4. Tổng kết về kết quả nghiên cứu

4.1. Nội dung 1: Đã xây dựng thành công mô hình Trường lực (dựa trên phương pháp

CoMFA) và mô hình Gaussian (dựa trên phương pháp CoMSIA) về mối quan hệ giữa hoạt

tính bắt gốc ABTS (được thể hiện bằng chỉ số TEAC) của 108 tripeptide với các chỉ số thống

kê đáng tin cậy.

4.2. Nội dung 2: Tổng hợp thành công 5 tryptophyllin L peptide và dẫn xuất được cụ thể trong

bảng 1.

Bảng 1. Năm peptide Tryptophyllin L và dẫn xuất đã được tổng hợp trong nghiên cứu.

Peptide Mạch amino acid KLPT

1 Leu-Pro-Trp-Tyr(OH) 576

2 Pro-Trp-Tyr(OH) 464

3 Pro-Trp-Tyr(NH2) 463

4 Pro-Tyr-Trp(NH2) 463

5

Peptide Mạch amino acid KLPT

5 Pro-Tyr-Trp(OH) 464

4.3. Nội dung 3: Các peptide được tinh chế thành công minh chứng bởi kết quả HPLC và MS.

4.4. Nội dung 4: Xác định được các peptide có hoạt tính chống oxi hóa cao nhất thông qua

thực ngiệm bắt gốc tự do ABTS và thực nghiệm khử sắt trong huyết tương (FRAP).

5. Đánh giá các kết quả đã đạt được và kết luận

Việc phát hiện ra các chất chống oxy hóa tự nhiên đã được thực hiện trong nhiều thập kỷ chủ

yếu dựa vào các phương pháp thực nghiệm thường liên quan đến các xét nghiệm sinh hóa đòi

hỏi thời gian và chi phí. Sự phát triển của lĩnh vực thống kê mô hình hóa mối quan hệ định

lượng giữa cấu trúc và hoạt tính đã cung cấp một cách tiếp cận thay thế để tìm kiếm và thiết

kế các hợp chất chống oxy hóa với chi phí được giảm bớt. Là một đóng góp cho cách tiếp cận

này, công trình này nhằm mục đích thiết lập quy trình sàng lọc kết hợp 3D-QSAR và thực

nghiệm để khám phá và thiết kế các chất chống oxy hóa tiềm năng từ cấu trúc các

tryptophyllin L được phân lập từ loài ếch cây đỏ Litoria rubella. Nghiên cứu này đã:

- Xây dựng thành công 2 mô hình 3D-QSAR là mô hình Trường lực (dựa trên phương

pháp CoMFA) và mô hình Gaussian (dựa trên phương pháp CoMSIA) về mối quan hệ giữa

hoạt tính bắt gốc ABTS (được thể hiện bằng chỉ số TEAC) của 108 tripeptide với các chỉ số

thống kê đáng tin cậy;

- Tổng hợp thành công 5 tryptophyllin L và dẫn xuất peptide hoạt động mạnh nhất PWY,

tryptophyllin L 4.1 và hai peptide mới được thiết kế PYW và PYW(NH2) peptide (Bảng 1);

- Các peptide được tinh chế thành công minh chứng bởi kết quả HPLC và phổ FTIR,

khối MS và MS/MS;

- Xác định được các peptide có hoạt tính chống oxi hóa cao nhất thông qua thực ngiệm

bắt gốc tự do ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) và thực nghiệm

khử sắt trong huyết tương (FRAP);

- So sánh kết quả chống oxi hóa tương đương Trolox từ thực nghiệm và dự đoán từ mô

hình cho thấy rằng các peptide này là chất bắt gốc ABTS mạnh với giá trị TEAC cao hơn

trolox xấp xỉ hai lần và cao hơn GSH.

6. Tóm tắt kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)

Mô hình Trường lực (Force-field model) và mô hình Gaussian 3D-QSAR được xây dựng với

các chỉ số thống kê cho thấy độ tin cậy cao về mặt dự đoán, được sử dụng để sàng lọc các