Tim hiểu vai trò của auxin trong sự phát sinh hình thái chồi in vitro từ mô phân sinh ngọn của cây đậu vigna angularis (willd.) ohwi et ohashi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

PHẠM MỸ NGỌC

TÌM HIỂU VAI TRÒ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT

SINH HÌNH THÁI CHỒI IN VITRO TỪ MÔ PHÂN SINH

NGỌN CỦA CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS (WILLD.)

OHWI ET OHASHI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS BÙI TRANG VIỆT

TS. LÊ THỊ TRUNG

Thành phố Hồ Chí Minh - 2011

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

PGS. TS. Bùi Trang Việt, Trưởng Bộ môn Sinh lý Thực vật Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên - ĐHQG Tp. HCM, người đã giảng dạy, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, tận tình

hướng dẫn em trong suốt quá trình học tập và hoàn chỉnh bài luận văn.

TS. Lê Thị Trung đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều

kiện thuận lợi nhất để em hoàn thành luận văn.

TS. Trần Thanh Hương, Th.S Trần Thị Thanh Hiền, Th.S Phan Ngô Hoang, Th.S

Trịnh Cẩm Tú đã tận tình giúp đỡ và đóng góp những ý kiến chân tình, những kinh nghiệm bổ ích

cho luận văn của em.

Quý thầy cô trong hội đồng đã dành thời gian đọc và đóng góp nhiều ý kiến cho luận

văn của em.

Ban chủ nhiệm và toàn thể quý thầy cô khoa Sinh Học trường ĐHSP thành phố Hồ

Chí Minh.

Các bạn cao học khoá 19, CN. Hồ Thị Mỹ Linh (Chuyên viên Phòng thí nghiệm khoa

Sinh trường ĐHSP thành phố Hồ Chí Minh) đã động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình

thực hiện luận văn.

Em Như (Cao học khoá 18 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh)

và các em Huyên, Phước, Quỳnh sinh viên năm thứ IV đang thực hiện đề tài tại Bộ môn Sinh lý

Thực vật Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, đã hỗ trợ tôi trong việc tìm

kiếm sách và tài liệu tham khảo.

MỤC LỤC

7TLỜI CẢM ƠN7T ......................................................................................................................1

7TMỤC LỤC7T ............................................................................................................................2

7TDANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT7T ..................................................................................6

7TMỞ ĐẦU7T ..............................................................................................................................7

7TCHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU7T .............................................................................8

7T1.1. Giới thiệu về cây Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi7T.................................8

7T1.1.1. Phân loại học7T ........................................................................................................8

7T1.1.2. Mô tả đặc điểm hình thái cây Đậu7T ........................................................................8

7T1.2. Sự phát sinh hình thái thực vật7T ....................................................................................8

7T1.2.1. Khái niệm7T.............................................................................................................8

7T1.2.2. Mô phân sinh ngọn chồi7T .......................................................................................9

7T1.2.2.1. Đặc điểm7T .......................................................................................................9

7T1.2.2.2. Cấu trúc của mô phân sinh ngọn chồi7T ..........................................................10

7T1.2.2.3. Sự phân bào của mô phân sinh ngọn chồi7T ....................................................11

7T1.2.3. Hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi7T ..............................................................11

7T1.2.3.1. Trong giai đoạn nảy mầm của hạt và tăng trưởng của cây mầm7T...................11

7T1.2.3.2. Trong giai đoạn sinh sản của cây trưởng thành7T ............................................12

7T1.2.4. Sự phát triển chồi7T ...............................................................................................12

7T1.2.4.1. Sự phát triển chồi nách7T ................................................................................12

7T1.2.4.2. Sự hình thành và phát triển chồi bất định7T.....................................................13

7T1.3. Vai trò của auxin và các chất điều hoà tăng trưởng thực vật trong sự phát sinh hình

thái ngọn chồi7T ..................................................................................................................14

7T1.3.1. Vai trò của auxin7T ................................................................................................14

7T1.3.2. Vai trò của cytokinin7T ..........................................................................................16

7T1.3.3. Sự phối hợp auxin và cytokinin trong phát sinh chồi7T ..........................................17

7T1.3.3.1. Tăng sinh chồi bên7T ......................................................................................17

7T1.3.3.3. Sự hình thành rễ7T ..........................................................................................18

7TCHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP7T ..............................................................19

7T2.1.Vật liệu7T ......................................................................................................................19

7T2.2.Phương pháp7T ..............................................................................................................19

7T2.2.1.Quan sát sự tăng trưởng cây Đậu đỏ Vigna angularis ở trong vườn7T .....................19

7T2.2.2.Khử trùng hạt7T ......................................................................................................19

7T2.2.3. Ảnh hưởng của AIA theo nồng độ lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây

Đậu đỏ7T .........................................................................................................................19

7T2.2.4. Ảnh hưởng của AIA 2 mg/l theo thời gian lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn

chồi cây Đậu đỏ7T ...........................................................................................................20

7T2.2.5. Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái chồi7T .....................21

7T2.2.5.1. Ảnh hưởng của BA riêng rẽ lên sự phát triển của khúc cắt ngọn chồi cây Đậu

đỏ in vitro 6 ngày tuổi7T ..............................................................................................21

7T2.2.5.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa AIA 2 mg/l và BA theo thời gian lên sự tăng

sinh và tăng trưởng chồi7T ...........................................................................................21

7T2.2.6. Quan sát hình thái giải phẫu7T ...............................................................................22

7T2.2.7. Đo cường độ quang hợp và cường độ hô hấp7T .....................................................23

7T2.2.8. Đo hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật7T ...........................................23

7T2.2.9.Xử lý số liệu7T ........................................................................................................23

7TCHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN7T ....................................................................24

7T3.1. Kết quả7T......................................................................................................................24

7T3.1.1. Quan sát sự tăng trưởng của cây trong vườn7T.......................................................24

7T3.1.2. Nuôi cấy hạt để tạo cây in vitro trên môi trường MS7T ..........................................26

7T3.1.3. Sự phát triển chồi mầm7T ......................................................................................26

7T3.1.3.1. Trong giai đoạn hạt nảy mầm7T ......................................................................26

7T3.1.3.2. Sự thay đổi trọng lượng tươi và trọng lượng khô theo thời gian từ giai đoạn

hạt đến cây mầm 5 ngày tuổi7T ....................................................................................27

7T3.1.3.3. Ảnh hưởng của các chất điều hoà tăng trưởng thực vật lên sự phát triển chồi

mầm7T .........................................................................................................................28

7T3.1.4. Các biến đổi hình thái của mô phân sinh ngọn chồi trong quá trình phát sinh chồi7T

.....................................................................................................................................30

7T3.1.5. Sự phát triển chồi nách từ cây in vitro và cây trong vườn7T ...................................33

7T3.1.5.1. Sự phát triển chồi nách từ nách tử diệp của cây in vitro7T ...............................33

7T3.1.5.2. Sự phát triển chồi nách từ nách lá của cây in vitro và cây trong vườn7T..........33

7T3.1.6. Quan sát hình thái giải phẫu của chồi nách7T .........................................................36

7T3.1.7. Ảnh hưởng của AIA theo nồng độ lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn chồi cây

Đậu đỏ7T .........................................................................................................................45

7T3.1.8. Ảnh hưởng của AIA 2 mg/l theo thời gian lên sự tăng trưởng của khúc cắt ngọn

chồi cây Đậu đỏ7T ...........................................................................................................47

7T3.1.8.1. Khảo sát sự tăng trưởng chồi trên môi trường AIA 2 mg/l và sau đó chuyển

sang môi trưòng MS theo thời gian7T ..........................................................................47

7T3.1.8.2. Khảo sát sự tăng trưởng chồi trên môi trường MS và sau đó chuyển sang môi

trưòng AIA 2 mg/l theo thời gian7T ............................................................................51

7T3.1.9. Sự thay đổi cường độ quang hợp và hô hấp của chồi ngọn sau khi xử lý AIA 2

mg/l theo thời gian7T .......................................................................................................54

7T3.1.10. Hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật nội sinh trong quá trình tăng

trưởng chồi7T...................................................................................................................55

7T3.1.11. Ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái chồi7T ...................57

7T3.1.11.1. Ảnh hưởng của BA riêng rẽ lên sự phát triển của khúc cắt ngọn chồi cây

Đậu đỏ in vitro 6 ngày tuổi7T.......................................................................................57

7T3.1.11.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa AIA 2 mg/l với BA theo thời gian lên sự

tăng sinh và tăng trưởng chồi7T ...................................................................................62

7T3.2. Thảo luận7T ....................................................................................................................1

7TCHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ7T .........................................................................12

7T4.1. Kết luận7T.....................................................................................................................12

7T4.2. Đề nghị7T .....................................................................................................................12

7TTÀI LIỆU THAM KHẢO7T .................................................................................................14

7TPHỤ LỤC7T ...........................................................................................................................18

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABA : Abcisic acid

AIA : Acetic indol acid

BA : Benzyl Adenin

CĐHTTTV : Chất điều hoà tăng trưởng thực vật

GR

1 R : ( G : gap, khoảng gián đoạn) - Tế bào ở trạng thái trưởng thành

GAR

3R : Giberelic acid

IBA : Indol Butyric acid

MS : Murashige và Skoog

TLT : Trọng lượng tươi

TLK : Trọng lượng khô

cs : cộng sự

MỞ ĐẦU

Phát sinh hình thái là cơ sở cho việc vi nhân giống thực vật mà hiện nay đang rất được

quan tâm. Sự phát sinh hình thái thực vật liên quan tới sự phát sinh liên tục mô và cơ quan mới ở

thực vật nhờ hoạt động của các nhóm tế bào gốc không phân hóa (undifferentiated stem cells) được

gọi là mô phân sinh. Hơn nữa, kiểm soát hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi ở mức phân tử dưới

tác động của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, đặc biệt là auxin và cytokinin, gần đây được

nghiên cứu bởi nhiều tác giả.

Do đó, đề tài tập trung nghiên cứu trên cây Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi,

rất thông dụng ở Việt Nam, để hiểu về hoạt động của mô phân sinh ngọn chồi dưới tác động của

auxin riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin. Việc khảo sát ảnh hưởng của auxin lên sự phát sinh hình

thái chồi ở cây Đậu được thực hiện dưới các khía cạnh hình thái học và sinh lý học, qua đó bổ sung

thêm kiến thức phục vụ cho công tác nghiên cứu, ứng dụng trong sự vi nhân giống và giảng dạy.

Ảnh 1.1. Cây Đậu đỏ

Vigna angularis (Willd.) Ohwi

et Ohashi

(http://www.botanyvn.com/cnt.a

sp?param=news&newsid=934)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về cây Đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi

1.1.1. Phân loại học

Cây Đậu được dùng trong đề tài này là cây Đậu đỏ, được phân loại như sau:

Ngành : 7TMagnoliophyta7T

Lớp : 7TMagnoliopsida7T

Bộ : 7TFabales7T

Họ : 7TFabaceae7T

Chi : 5TVigna

5TLoài : 5TVigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi (Phạm Hoàng

Hộ, 1999)

1.1.2. Mô tả đặc điểm hình thái cây Đậu

Cây Đậu đỏ (adzuki bean) là loại cỏ nhất niên, đứng

hay leo. Cây có chiều cao trung bình 50-80 cm, có cạnh và lông

dài. Cuống lá dài 10-12 cm, có lông. Lá thường có hình xoan,

đầu tròn, có thùy, dài 6-8 cm và có lông. Mỗi lá gồm 4-5 cặp

gân phụ. Hoa mọc thành chùm ở nách lá, dài 3-10 cm, có màu

vàng nhạt. Đài hoa có 5 răng ngắn. Trái dài 6-10 cm và rộng

0,7 cm, có chót nhọn. Hột dài 6-10 mm, có màu nâu. Bộ nhiễm

sắc thể của Đậu đỏ 2n = 22.

Cây Đậu đỏ được trồng nhiều ở Nha Trang, Sài

Gòn,… và được trồng để lấy hạt.

Công dụng của cây Đậu đỏ : rễ dùng để đắp trị sưng;

hột giúp lợi tiểu, trị kiết… (Phạm Hoàng Hộ, 1999).

1.2. Sự phát sinh hình thái thực vật

1.2.1. Khái niệm

Sự phát sinh hình thái thực vật là sự phát triển cơ thể thực vật theo thời gian để hoàn tất

chu trình phát triển. Phát triển chỉ những thay đổi của tế bào, mô hay cơ quan từ lúc khởi đầu cho

đến lúc trưởng thành. Phát sinh hình thái thực vật bao gồm phát sinh mô (histogenesis), phát sinh cơ

quan (organogenesis) và phát sinh phôi (embryogenesis) (Bùi Trang Việt, 2000).

Trong sự phát sinh cơ quan in vitro, có thể tạo các cơ quan theo con đường phát sinh cơ

quan trực tiếp (các cơ quan tạo ra trực tiếp từ mẫu cấy) hay gián tiếp (mẫu cấy tạo mô sẹo, sau đó

các cơ quan tạo ra từ mô sẹo này) (Bùi Trang Việt, 2000).

Sự phát sinh hình thái thực vật tùy thuộc hai quá trình căn bản sau:

- Sự điều hoà hướng kéo dài tế bào.

- Sự kiểm soát vị trí và hướng của mặt phẳng phân chia của tế bào.

Chính kiểu tăng trưởng của mọi tế bào riêng rẽ quyết định hình thái của cơ quan và cơ thể

thực vật (Bùi Trang Việt, 2000).

Sự phát triển ở mức tế bào thể hiện qua hai chuỗi thay đổi: tăng trưởng (phân chia và kéo

dài tế bào) và phân hóa tế bào. Ở thực vật, sự phân chia và kéo dài tế bào tách biệt nhau theo không

gian và thời gian (Bùi Trang Việt, 2000).

Môn phát sinh hình thái là môn học nhằm mô tả các biến đổi hình thái và cấu trúc, phân

tích các yếu tố nội sinh và ngoại sinh, và nghiên cứu sự điều hòa hình thái thực vật.

Sự phát sinh hình thái liên quan một cách toàn diện đến nguồn gốc và sự phát triển hình

thái thực vật. Do đó, không có một kỹ thuật hay phương pháp riêng rẽ nào có thể chứng minh được

tất cả mọi khía cạnh của nó. Những kỹ thuật của nhiều lĩnh vực khác nhau như mô học, giải phẫu

học, sinh lý học, tế bào học và di truyền học đều có thể giúp tìm hiểu hiện tượng phát sinh hình thái.

Trong số các phương pháp thực nghiệm, hai phương pháp được dùng nhiều nhất là:

- Cắt bỏ một vùng lân cận của mô phân sinh và theo dõi các biến đổi phát triển sau đó.

- Nuôi cấy in vitro trong điều kiện vô trùng và có kiểm soát các phần tách rời của một

cơ thể thực vật.

Trong các thí nghiệm in vitro, các nghiên cứu sinh lý học thường khó tiến hành do kích

thước quá nhỏ bé của các loại mô cấy, nên sự áp dụng các chất điều hoà sinh trưởng thực vật ngoại

sinh là cách hữu hiệu để tìm hiểu về sự phát sinh hình thái thực vật (Bùi Trang Việt, 2000).

Sự phát sinh hình thái thực vật liên quan tới sự phát sinh liên tục mô và cơ quan mới ở

thực vật nhờ hoạt động của các nhóm tế bào gốc không phân hóa (undifferentiated stem cells) được

gọi là mô phân sinh (Vernoux và cs, 2010).

1.2.2. Mô phân sinh ngọn chồi

1.2.2.1. Đặc điểm