Thử nghiệm hiệu quả chủng vi khuẩn Lactic có đồng thời hoạt tính Probiotic và giảm Cholesterol trên mô hình chuột thí nghiệm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THỬ NGHIỆM HIỆU QUẢ CHỦNG VI KHUẨN

LACTIC CÓ ĐỒNG THỜI HOẠT TÍNH

PROBIOTIC VÀ GIẢM CHOLESTEROL TRÊN

MÔ HÌNH CHUỘT THÍ NGHIỆM

Sinh viên thực hiện: Phạm Thị Minh Trang

Nguyễn Thị Linh Giang

Lê Thị Anh Thiện

Phạm Trần Phương Dung

Người hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh

TP. Hồ Chí Minh, 2013

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC LỜI CÁM ƠN

SVTH : PHẠM THỊ MINH TRANG i

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn chân thành, em xin cảm ơn đến

Th.S Dƣơng Nhật Linh và Th.S Nguyễn Văn Minh - giảng viên khoa Công

Nghệ Sinh Học, trƣờng ĐH. Mở Tp. Hồ Chí Minh là những ngƣời đã truyền đạt những

kinh nghiệm quý báu trong cuộc sống, luôn bên cạnh động viên và tạo điều kiện cho

em trong suốt thời gian học đại học và hoàn thành nghiên cứu .

Xin tỏ lòng biết ơn đến quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học, trƣờng ĐH. Mở

Tp. Hồ Chí Minh. Cảm ơn thầy cô đã luôn tận tình chỉ dạy những kiến thức quý báu

cho em trong 4 năm đại học.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến sự giúp đỡ tận tình của thầy

PGS.TS Trần Cát Đông – Trƣởng bộ môn vi ký sinh trùng, các thầy cô cùng toàn thể

các anh chị trong bộ môn dƣợc lý – Trƣờng Đại học Y dƣợc TP.HCM đã hỗ trợ em rất

nhiều trong quá trình hoàn thành đề tài nghiên cứu.

Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Thanh Thuận - giảng viên trƣờng đại

học Thủ Dầu Một đã tạo điều kiện, giúp đỡ em hoàn thành đề tài.

Em xin gửi lời cảm ơn cô Tôn Nữ Tùng Kim-giảng viên khoa Công Nghệ Sinh

học, toàn thể các anh/chị và các bạn phòng sinh học phân tử đã tạo điều kiện thuận lợi

cho em hoàn thành nghiên cứu.

Xin gửi lời cảm ơn đến anh Đan Duy Pháp, ngƣời đã luôn giúp đỡ, truyền đạt

những kiến thức thực tế trong quá trình nghiên cứu. Chị Võ Ngọc Yến Nhi, chị đã

luôn bên cạnh, theo sát và là ngƣời chia sẻ buồn vui trong suốt thời gian thực hiện đề

tài.

Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể các anh/chị, các bạn, các em trong phòng thí

nghiệm CN. Vi Sinh, trƣờng ĐH. Mở Tp. Hồ Chí Minh đã luôn giúp đỡ và động viên

tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài.

Và tận đáy lòng, con vô cùng biết ơn gia đình đã là điểm tựa vũng chắc, hỗ trợ,

động viên và tạo điều kiện cho con đƣợc nhƣ ngày hôm nay.

Bình Dƣơng, ngày 21 tháng 04 năm 2013

Phạm Thị Minh Trang

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC MỤC LỤC

SVTH : PHẠM THỊ MINH TRANG ii

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................................................1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................1

1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC .........................................................................................2

1.1.1. Khái niệm ....................................................................................................................................... 2

1.1.2. Quá trình chuyển hóa và tác dụng của probiotic........................................................................ 2

1.1.3. Tiêu chí chọn lọc chủng probiotic (Dƣơng Thanh Liêm, 2009) ................................................... 5

1.1.4. Tình hình nghiên cứu probiotic trong và ngoài nƣớc................................................................. 7

1.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC..........................................................................10

1.3. TỔNG QUAN VỀ CHOLESTEROL................................................................................12

1.3.1. Giới thiệu...................................................................................................................................... 12

1.3.2. Chức năng .................................................................................................................................... 13

1.3.3. Phân loại ...................................................................................................................................... 14

1.3.4. Tổng hợp cholesterol ................................................................................................................... 15

1.3.5. Cơ chế điều hòa lƣợng cholesterol trong máu........................................................................... 16

1.3.6. Bài tiết........................................................................................................................................... 17

1.3.7. Chuyển hóa bởi vi sinh vật.......................................................................................................... 17

1.4. PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI SINH VẬT...............................................................18

1.4.1. Định danh vi sinh vật bằng phƣơng pháp truyền thống .......................................................... 18

1.4.2. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật giải trình tự .................................................................... 18

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................21

2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ..................................................................22

2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU................................................................................................22

2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................................................................. 22

2.2.2. Các chủng vi khuẩn thử nghiệm................................................................................................. 22

2.2.3. Môi trƣờng – hóa chất................................................................................................................. 23

2.2.4. Thuốc thử - thuốc nhuộm............................................................................................................ 23

2.2.5. Dụng cụ......................................................................................................................................... 24

2.2.6. Trang thiết bị ............................................................................................................................... 24

2.3. SƠ ĐỒ THÍ NGHIỆM........................................................................................................25

2.3.1. Tái phân lập ................................................................................................................................. 26

2.3.2. Sàng lọc các chủng có khả năng hấp thu cholesterol của tế bào vi khuẩn từ môi trƣờng nuôi

cấy 26

2.3.3. Sàng lọc chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme BSH ........................................................ 27

2.3.4. Thử khả năng sinh enzym ngoại bào ......................................................................................... 31

2.3.5. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn ............................................................................................... 33

2.3.6. Khả năng chịu pH dạ dày ........................................................................................................... 34

2.3.7. Khả năng chịu mật ...................................................................................................................... 35

2.3.8. Thử khả năng nhạy cảm với kháng sinh(MIC)......................................................................... 36

2.3.9. Kiểm tra khả năng huyết giải .................................................................................................... 37

2.3.10. Định danh bằng kỹ thuật giải trình tự .................................................................................. 37

2.3.11. Xây dựng mô hình gây tăng cholesterol trên chuột ............................................................ 41

2.3.12. Khảo sát khả năng giảm cholesterol...................................................................................... 41

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ......................................................44

3.1. TÁI PHÂN LẬP..................................................................................................................45

3.2. SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG GIẢM

CHOLESTEROL.............................................................................................................................45

3.2.1. Thử nghiệm khả năng giảm cholesterol trong môi trƣờng nuôi cấy ....................................... 45

3.2.2. Định tính khả năng sinh enzyme BSH ....................................................................................... 52

3.2.3. Xác định hoạt tính enzyme BSH................................................................................................. 55

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC MỤC LỤC

SVTH : PHẠM THỊ MINH TRANG iii

3.2.4. Kết quả xác định hoạt độ chung và hoạt độ riêng enzyme BSH của các chủng khảo sát...... 58

3.3. SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH PROBIOTIC CAO ..........62

3.3.1. Khả năng sinh enzyme ngoại bào ............................................................................................... 62

3.3.2. Hoạt tính kháng khuẩn ............................................................................................................... 64

3.3.3. Khả năng chịu muối mật............................................................................................................. 68

3.3.4. Khả năng chịu pH dạ dày ........................................................................................................... 70

3.3.5. Kiểm tra khả năng huyết giải ..................................................................................................... 72

3.3.6. THỬ NGHIỆM NHẠY/ KHÁNG KHÁNG SINH.................................................................... 74

3.4. TÓM TẮT KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỒNG THỜI HOẠT TÍNH PROBIOTIC VÀ

KHẢ NĂNG GIẢM CHOLESTEROL CỦA 39 CHỦNG THỬ NGHIỆM ...............................77

3.5. ĐỊNH DANH BẰNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ....................................80

3.5.1. Tách chiết, PCR và tinh sạch sản phẩm 16S rDNA.................................................................. 80

3.5.2. Kết quả giải trình tự và dựng cây phát sinh loài: ..................................................................... 81

3.6. KẾT QUẢ XÂY DỰNG MÔ HÌNH TĂNG CHOLESTEROL TRÊN CHUỘT..........85

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................87

4.1. KẾT LUẬN..........................................................................................................................88

4.2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................................................88

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC DANH MỤC VIẾT TẮT

SVTH : PHẠM THỊ MINH TRANG iv

DANH MỤC VIẾT TẮT

MT Môi trƣờng

KL Khuẩn lạc

v/p Vòng/phút

TB Tế bào

OD Optical Density

LAB Lactic acid bacteria

HHD Homofermentative-Heterofermentative Differrential

medium

WHO World Health Organization

GRAS Generally recognized as safe

BSH Bile salt hydrolase

LDL Low Density Lipoprotein

HDL High Density Lipoprotein

nm nanomet

16S rDNA Trình tự DNA mã hóa cho RNA ribosome tiểu phần

16S

ANOVA One-way analysis of variance

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

bp base pair

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC DANH MỤC

SVTH : PHẠM THỊ MINH TRANG v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các giống khác nhau của vi khuẩn lactic.......................................................11

Bảng 2.1. Xây dựng đồ thị đƣờng chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ

cholesterol và giá trị OD550............................................................................................26

Bảng 2.2. Xây dựng đồ thị đƣờng chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ taurine

và giá trị OD570 ..............................................................................................................28

Bảng 2.3. Xây dựng đồ thị đƣờng chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ Albumin

và giá trị OD595 ..............................................................................................................29

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR ............................................................................39

Bảng 2.5 Chƣơng trình phản ứng PCR..........................................................................39

Bảng 3.1 Bảng tóm tắt kết quả sàng lọc đồng thời hoạt tính probiotic và khả năng giảm

cholesterol của 10 chủng vi khuẩn ................................................................................78

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1. Sự tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ cholesterol (µg/mL) và giá trị

OD550..............................................................................................................................46

Đồ thị 3.2 Khả năng giảm cholesterol trong môi trƣờng của các chủng thử nghiệm ...51

Đồ thị 3.3 Khả năng giảm cholesterol trong môi trƣờng của các chủng thử nghiệm ...51

Đồ thị 3.4 Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ taurine (mM) và giá trị OD570 56

Đồ thị 3.5 Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ BSA (µg/0,2mL) và giá trị

OD595..............................................................................................................................57

Đồ thị 3.6 Biểu diễn hoạt độ chung (U/mL) và hoạt độ riêng (U/mg) của các chủng vi

khuẩn .............................................................................................................................61

Đồ thị 3.7 Đồ thị biểu diễn khả năng chịu muối mật của các chủng vi khuẩn..............69

Đồ thị 3.8 Tỉ lệ sống của các chủng thử nghiệm theo thời gian 1, 2 và 3 giờ ở pH 2...71

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC DANH MỤC

SVTH : PHẠM THỊ MINH TRANG vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hệ vi sinh vật tồn tại trong hệ thống tiêu hóa .................................................4

Hình 1.2. Mô tả một số ảnh hƣởng của vi khuẩn khi vào cơ thể.....................................5

Hình 1.3. Streptococcus (66).........................................................................................12

Hình 1.4. Lactobacillus (61)..........................................................................................12

Hình 1.5. Công thức cấu tạo cholesterol .......................................................................13

Hình 1.6. Cholesterol hình thành các mảng bám trong mạch máu. ..............................14

Hình 1.7. Cơ chế tổng hợp cholesterol..........................................................................15

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm............................................................................................25

Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm hiệu quả giảm cholesterol........................................42

Hình 3.1. Vi khuẩn trên môi trƣờng MRSA..................................................................45

Hình 3.2. Khả năng sinh enzyme BSH..........................................................................55

Hình 3.3. Khả năng sinh enzyme ngoại bào..................................................................64

Hình 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn S.typhi, L. monocytogenes ..................68

Hình 3.5. Kết quả thử tiêu huyết trên thạch máu...........................................................74

Hình 3.6. Thử nghiệm MIC của chủng E16.2 ...............................................................76

Hình 3.7. Kết quả điện di sau phản ứng PCR................................................................80

Hình 3.8 Trình tự của chủng NT1.5 sau khi hiệu chỉnh................................................81

Hình 3.9 Trình tự của chủng E16.2 sau khi hiệu chỉnh.................................................82

Hình 3.10 Trình tự của chủng YK1.1 sau khi hiệu chỉnh .............................................82

Hình 3.12 Cây phả hệ phân tử của 3 chủng định danh..................................................84

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐẶT VẤN ĐẾ

SVTH : PHẠM THỊ MINH TRANG 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo một cuộc khảo sát gần đây của tổ chức Y tế thế giới, bệnh tim mạch vành

là nguyên nhân chính dẫn đến tử vong và đƣợc dự báo sẽ gia tăng. Ƣớc tính khoảng

17,5 triệu ngƣời chết vì bệnh tim mạch trong năm 2005, chiếm 30% của tất cả các ca

tử vong trên toàn cầu. Trong số các ca tử vong 7,6 triệu là do các cơn đau tim và 5,7

triệu do đột quỵ. Khoảng 80% các ca tử vong xảy ra ở các nƣớc có thu nhập thấp và

trung bình. Nếu xu hƣớng hiện nay đƣợc phép tiếp tục, ƣớc tính đến năm 2015 có 20

triệu ngƣời sẽ chết vì đột quỵ, bệnh tim mạch. Do đó giảm cholesterol trong máu đã và

đang trở thành vấn đề cấp bách, đƣợc khá nhiều các nhà khoa học trên thế giới quan

tâm và nghiên cứu.

Bệnh tim mạch là nguyên nhân quan trọng nhất dẫn đến tử vong và nó liên quan

chặt chẽ với việc tăng cholesterol. Vì vậy giảm cholesterol huyết thanh là điều rất quan

trọng để ngăn ngừa bệnh tim mạch (Livia Alm và cs., 1982).

Do đó việc nghiên cứu các phƣơng pháp làm giảm cholesterol trong máu là vấn

đề mà các nhà khoa học quan tâm và theo các nghiên cứu cho thấy rằng có nhiều

phƣơng pháp làm giảm cholesterol trong máu nhƣ: sử dụng thuốc giúp làm giảm lƣợng

choleterol nhƣ: statins, các loại thuốc ức chế, fibrates, acid bile resin, niacin… nhƣng

khi sử dụng các loại thuốc này có thể gây ra một số tác dụng phụ. Trong những năm

gần đây có nhiều nghiên cứu chứng minh bile salt hydrolase (BSH) từ vi khuẩn (

Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus,…) có tác dụng làm giảm cholesterol ở

ngƣời và động vật (Ma´ire Begley, 2006; Martin D. và cs., 2006; Pardo I. và cs.,

1992). Sử dụng probiotic chứa vi khuẩn có bile salt hydrolase theo đƣờng uống đã

đƣợc chứng minh giảm đáng kể cholesterol từ 22 – 33% (De Smet I và cs., 1994; De

Smet I và cs., 1995) hoặc ngăn chặn cholesterol cao ở chuột khi cho ăn một chế độ ăn

giàu chất béo.

Đây là vấn đề đang đƣợc các nhà khoa học ngoài nƣớc quan tâm nghiên cứu và

ở Việt Nam, hiện chƣa có nghiên cứu liên quan đến vấn đề này, trong khi sản phẩm

probiotic có tác dụng làm giảm cholesterol là rất cần thiết.

Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “THỬ NGHIỆM HIỆU QUẢ

CHỦNG VI KHUẨN LACTIC CÓ ĐỒNG THỜI HOẠT TÍNH PROBIOTIC VÀ

GIẢM CHOLESTEROL TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT THÍ NGHIỆM”

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐẶT VẤN ĐẾ

SVTH : PHẠM THỊ MINH TRANG 2

Chúng tôi thực hiện đề tài với các mục tiêu sau:

- Tái phân lập và sàng lọc các chủng đồng thời có hoạt tính probiotic và giảm

cholesterol.

- Định danh các chủng vi khuẩn theo phƣơng pháp sinh học phân tử.

- Xây dựng mô hình chuột gây tăng cholesterol.

Do thời gian thực hiện nghiên cứu có hạn nên chúng tôi chƣa thực hiện thử

nghiệm hiệu quả giảm cholesterol của các chủng trên mô hình chuột nhƣ đúng đề

cƣơng đăng ký.

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TỔNG QUAN TÀI LIỆU

SVTH : PHẠM THỊ MINH TRANG 1

CHƢƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TỔNG QUAN TÀI LIỆU

SVTH : PHẠM THỊ MINH TRANG 2

1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC

1.1.1. Khái niệm

Năm 1965, Lilly và Stillwell lần đầu tiên sử dụng thuật ngữ probiotic để mô tả

những chất tiết ra từ vi sinh vật mà có khả năng kích thích sự phát triển của vi sinh vật

khác (Lilly D. M & Stillwell R. H., 1965).

1974, Parker sử dụng thuật ngữ “probiotic” để định nghĩa „ sinh vật và các chất

góp phần cân bằng vi khuẩn đƣờng ruột‟. 1991, probiotic đã đƣợc định nghĩa là vi sinh

vật sống bổ sung vào thức ăn có lợi cho động vật bằng cách cải thiện sự cân bằng hệ

vi khuẩn của nó (Fuler R và cs., 1991).

Cho tới 2002, theo định nghĩa của FAO/WHO, “Probiotic là những vi sinh vật

sống mà khi đƣa vào cơ thể đƣợc kiểm soát, với số lƣợng thích hợp sẽ mang lại hiệu

quả cho vật chủ”. Đây là định nghĩa tổng quát nhất (FAO/WHO, 2001).

Probiotic có lợi khi cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột bị biến đổi bằng cách tái

thiết lập hệ cân bằng vi sinh vật đƣờng ruột sau khi bị rối loạn do tiêu chảy, điều trị

kháng sinh và điều trị bằng tia X, tia beta; ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn có hại,

thúc đẩy tiêu hóa tốt, tăng cƣờng chức năng miễn dịch và tăng khả năng chống nhiễm

trùng (Nguyễn Lân Dũng, 1983).

Ngoài ra, các lợi ích sinh lý khác bao gồm loại bỏ các chất gây ung thƣ, giảm

cholesterol (Maire beggley & cs., 2006; Mai Đàm Linh và cs., 2008), kích thích miễn

dịch và giảm khả năng dị ứng, tổng hợp và tăng cƣờng khả dụng sinh học của các chất

dinh dƣỡng (Christine M. K. và cs., 2009).

1.1.2. Quá trình chuyển hóa và tác dụng của probiotic

1.1.2.1. Hệ vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn lactic

Lactic acid bacteria (LAB) là một nhóm vi khuẩn chính bên trong ống tiêu hóa

của con ngƣời có tác dụng tăng cƣờng sức khỏe và quá trình lên men sản xuất acid

lactic. Đa phần chúng đƣợc coi là an toàn (GRAS_generally regarded as safe)

(Christine M. Kalui và cs., 2010). Một số vị trí trong cơ thể tìm thấy sự hiện diện của

vi khuẩn lactic nhƣ là miệng, tai, mũi, hệ hô hấp và đƣờng ruột cùng với ống niệu sinh

dục. Hệ vi sinh vật này tăng cƣờng tiết các chất có lợi cho cơ thể nhƣ vitamin K, B12

và bacteriocin. Vì vậy, chúng góp phần bình ổn hệ vi sinh những khu vực này và

chống các bệnh truyền nhiễm. Những rối loạn của hệ vi khuẩn này do nhiều nguyên

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TỔNG QUAN TÀI LIỆU

SVTH : PHẠM THỊ MINH TRANG 3

nhân nhƣ stress, sử dụng kháng sinh không kiểm soát và những tác động cơ học quá

mức vào các cơ quan hở sẽ dẫn đến những bệnh lý viêm nhiễm dễ dàng hơn. Do đó,

chế độ ăn có bổ sung các vi khuẩn sống có lợi này sẽ nâng cao sức khỏe và giảm nhiều

loại bệnh nguy hiểm. Vi khuẩn lactobacilli đóng vai trò quan trọng trong việc nâng

cao miễn dịch, duy trì sự cân bằng vi khuẩn ruột và tránh nhiễm trùng tiêu hóa. Việc

điều tiết miễn dịch là yếu tố quan trọng góp phần kháng viêm, kháng nhiễm và hạn chế

ung thƣ (Paul G. Engelkirk và Gwendolyn R. W. Burton).

Tuy nhiên, ngày nay cơ chế đáp ứng miễn dịch của vi khuẩn lactic vẫn chƣa

đƣợc hiểu biết đầy đủ. Những bằng chứng vách tế bào Lactobacillus bao gồm những

thành phần miễn dịch nhƣ là polysaccharid, peptidoglycan và bacteriocin, là những

chất có khả năng gây đáp ứng miễn dịch (Meydani & Ha, 2000; Cotter và cs, 2005).

Nhiều chủng Lactobacilli làm tăng đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thích

nghi qua việc cảm ứng sự trƣởng thành của tế bào DC (dendritic cell) và kích thích

những tế bào miễn dịch để phóng thích các cytokines bao gồm interferon-gamma

(IFN-γ) và interleukin-12 (IL-12) (Perdigon và cs, 1999).