Thiết kế vector mang cấu trúc gen liên quan đến khả năng chống chịu ở cây đậu xanh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-------

THIẾT KẾ

ẬU XANH

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2011

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,

kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng có ai công bố trong

bất kỳ một công trình nào khác.

Tác giả

Võ Thị Minh Hòa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn

Vũ Thanh Thanh, Khoa Khoa học Sự sống, trƣờng Đại học Khoa học - Đại học

Thái Nguyên và TS. Lê Văn Sơn, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công

nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là những ngƣời đã tận

tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện

và hoàn thành luận văn này.

Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS. Lê Trần Bình,

PGS.TS. Chu Hoàng Hà, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ

Sinh học, là những ngƣời đã tạo điều kiện và đóng góp những ý kiến quý báu

cho tôi trong suốt thời gian thự .

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới CN. Hoàng Hà, Phòng Công nghệ tế

bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận

văn tốt nghiệp này. Trong thời gian thực tập nghiên cứu, tôi cũng đã nhận đƣợc

sự hỗ trợ nhiệt tình và những ý kiến đóng góp bổ ích của các cô chú, các anh chị

và các bạn trong Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.

Tôi xin cảm ơn chân thành các thầy cô giáo trong khoa Khoa học sự sống￾trƣờng Đại học Khoa học-Đại học Thái Nguyên đã hƣớng dẫn, truyền đạt kiến

thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi cũng vô cùng cảm ơn những tình cảm tốt đẹp của những ngƣời thân

trong gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi

trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu.

, ngày 06 tháng 10 năm 2011

Học viên

Võ Thị Minh Hòa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

MỤC LỤC

...........................................................................................

...........................................................................................

...............................................................................................

....................................................................................................

........................................................................

...................................................................................

..................................................................................

MỞ ĐẦU ........................................................................................................

1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................

2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................

3. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................

4. Ý nghĩa khoa học của đề tài .......................................................................

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................

1.1.

..............................................……………......

.................................. .......

............................. ...........................

1.1.2.2. T .................

1.2. HẠN VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA TÍNH CHỊU HẠN

..........................................................................................................

1.2.1. đối với cây trồng ………………….

1.2.2. Cơ sở hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn ..

1.3. GEN VÀ PROTEIN LTP (Lipid Transfer Protein) ................................

1.3.1. Gen LTP ………………………………………………………….......

1.3.2. Protein (LTP) ……………………………………...

1.4. KỸ THUẬT CHUYỂN GEN THÔNG QUA A.tumefaciens …….

1.4.1. Vi khuẩn A. tumefaciens và hiện tƣợng biến nạp gen vào thực vật .....

1.4.2. ..................................................................................

1.4.3. Các …….......

Trang

i

ii

iii

iv

1

1

2

2

3

4

4

4

6

6

8

10

10

11

15

15

17

18

18

19

20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

1.4.4. Thành tựu chuyển gen ở thực vật ……………………………….........

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................

2.1. V ………………………………….................

...................................

...................................................................................

2.2. P ……………………………………......

2.2.1. .....………………………………………

2.2.2. ........................... ………………………..

2.2.3. en LTP .... ………………………

2.2.4. ………………………….......

......................................................

..............................................

A. tumefaciens CV58C1

A.

tumefaciens CV58C1 .................................................................................

.........................

..................................................................

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................

3.1. PHÂN LẬP GEN LTP ……………………………………………........

3.1.1. Thiết kế mồi ……………………………………………………..........

3.1.2. Tách RNA tổng số tổng hợp cDNA ….......................................

3.1.3. Kết quả PCR LTP …………………………………..

3.1.4. ..................................................................

3.1.5. Kết quả xác định trình tự nucleotide ....................................................

3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN ...................................................

3.2.1. Ghép nối đoạn gen LTP vào vector chuyển tiếp pRTRA7/3............

3.2.2. Thiết kế vector tái tổ hợp pCB301 mang gen LTP ..........................

3.2.3. Kết quả biến nạp pCB301-LTP vào vi khuẩn A. tumefaciens...

3.2.4. Kết quả kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp trong các dòng

khuẩn lạc bằng colony-PCR .....................................................................

3.3. CHUYỂN GEN VÀ KIỂM TRA SỰ CÓ MẶT CỦA GEN LTP Ở

21

24

24

24

25

26

27

27

27

28

29

33

34

35

36

37

38

38

38

38

39

40

41

43

43

43

46

46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

CÂY THUỐC LÁ......................................................................................

3.3.1. Kết quả chuyển gen LTP vào cây thuốc lá ..........................................

3.3.2. Kết quả kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR ............

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................

NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI .........

TRÌNH TỰ GEN ĐĂNG KÝ TRÊN NGÂN HÀNG GEN EMBL..............

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..............................................................................

48

48

50

51

52

52

53

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

BAP 6-Benzyl Amino Purine (Benzyladeninpurin)

bp Base pair

cDNA Complementary DNA

cs Cộng sự

DEPC Diethyl pyrocarbonat

DNA Deoxyribonucleic Acid

dNTP deoxynucleosit triphotphat (deoxynucleoside triphosphate)

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

EtBr Ethiium bromide

E.coli Escherichia coli

Gus β-glucuronidase

IBA Indole-3-Butyric Acid

Kb kilo base

LB Luria and Bertani

MS Murashige và Skoog

NAA Naphthalene Acetic Acid

OD Optical density (Giá trị mật độ quang)

PCR Polymerase Chaine Reaction

RNA Ribonucleic Acid

RNase Ribonuclease

RT-PCR Reverse Transcriptase-PCR

SDS Sodium dodecylsulfat

TAE Tris-acetate-EDTA

Taq Thermus aquaticus