Thiết kế Baculovirus tái tổ hợp mang gen mã hóa protein M1 của virus cúm A/H5N1 để tạo chủng sản xuất vaccine thế hệ mới bằng công nghệ virus-like particle

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

----------------------------------------

Nguyễn Thị Phương

THIẾT KẾ BACULOVIRUS TÁI TỔ HỢP MANG GEN MÃ HÓA

PROTEIN M1 CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ĐỂ TẠO CHỦNG SẢN

XUẤT VACCINE THẾ HỆ MỚI BẰNG CÔNG NGHỆ VIRUS￾LIKE PARTICLE

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hà Nội – 2013

Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu http://www.lrc.tnu.edu.vn/

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

----------------------------------------

Nguyễn Thị Phương

THIẾT KẾ BACULOVIRUS TÁI TỔ HỢP MANG GEN MÃ

HÓA PROTEIN M1 CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ĐỂ TẠO

CHỦNG SẢN XUẤT VACCINE THẾ HỆ MỚI BẰNG CÔNG

NGHỆ VIRUS-LIKE PARTICLE

Chuyên ngành: Hóa sinh

Mã số : 06 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐỒNG VĂN QUYỀN

Hà Nội – 2013

Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu http://www.lrc.tnu.edu.vn/

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Đồng Văn

Quyền – Trưởng phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ sinh học đã

dìu dắt, hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt

nghiệp của mình. Đồng thời, TS luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể

hoàn thành các công việc chuyên môn tại phòng.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Đinh Duy Kháng và các anh chị,

các bạn đồng nghiệp tại phòng Vi sinh vật học phân tử đã quan tâm, chia sẻ

và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban

Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ

và tạo điều kiện cho tôi sử dụng các thiết bị hiện đại để có thể thực hiện đề tài

này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo tham gia công tác và giảng

dạy tại Phòng đào tạo sau đại học, trường Đại học Thái Nguyên – Viện Sinh

thái và Tài nguyên Sinh vật đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình học tập.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và

động viên để tôi có thể hoàn thành khóa học của mình.

Hà Nội, ngày 11 tháng 11 năm 2013

Học viên

Nguyễn Thị Phương

Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu http://www.lrc.tnu.edu.vn/

MỤC LỤC

MỤC LỤC ..............................................................................................................4

ĐẶT VẤN ĐỀ.........................................................................................................1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................3

1.1. Khái quát về bệnh cúm gia cầm.....................................................................3

1.1.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới............................................................3

1.1.2. Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam...........................................................4

1.1.3. Con đường lây nhiễm và triệu chứng bệnh..............................................5

1.1.4. Chẩn đoán, phòng và điều trị bệnh do virus H5N1..................................7

1.2. Virus cúm A/H5N1 gây bệnh trên gia cầm....................................................8

1.2.1. Đặc điểm cấu tạo ....................................................................................8

1.2.2. Cấu trúc hệ gen.......................................................................................9

1.2.3. Cơ chế gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ .........................12

1.2.4. Các kháng nguyên quan trọng của Virus cúm A/H5N1.........................14

1.3.1. Nguồn gốc, sự phát triển của vaccine....................................................17

1.3.2. Vaccine VLP ........................................................................................20

1.3.2.1. Khái quát về VLP...........................................................................20

3.2.2. Phương pháp tạo VLP.......................................................................21

3.2.3. Đặc điểm của vaccine VLP ...............................................................23

3.2.4. Cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch của VLP ............................................24

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................27

2.1. Vật liệu .......................................................................................................27

2.2. Phương pháp ...............................................................................................27

2.2.1. Tách chiết RNA tổng số ........................................................................27

2.2.2. Phương pháp tổng hợp cDNA...............................................................28

2.2.3. Thiết kế hộp gen m1 của virus cúm A/H5N1 .........................................29

2.2.4. Phương pháp gắn đoạn DNA ngoại lai vào vector................................30

2.2.5. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli .............................................30

2.2.6. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn.....................................................31

Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu http://www.lrc.tnu.edu.vn/

2.2.7. Phương pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn.......................................32

2.2.8. Tinh sạch plasmid.................................................................................32

2.2.9. Xác định trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động.....................32

2.2.10. Tách chiết DNA tổng số từ baculovirus tái tổ hợp...............................34

2.2.11. Chuẩn bị tế bào Sf9 cho quá trình đồng chuyền nạp ...........................34

2.2.12. Phương pháp cấy chuyển tế bào côn trùng..........................................35

2.2.13. Đồng chuyển nạp (co-transfection).....................................................35

2.2.14. Kiểm tra sự có mặt gen m1 trong tế bào côn trùng Sf9 bằng PCR.......36

2.2.15. Kiểm tra sự biểu hiện của protein M1 bằng Western blot....................37

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................38

3.1. Kết quả tách chiết RNA ..............................................................................38

3.2. Khuếch đại gen m1 .....................................................................................38

3.2.2. Tách dòng gen m1 ................................................................................39

3.2.3. Thiết kế vector trung gian baculovirus mang hộp gen m1 .....................43

3.3. Chuẩn bị tế bào côn trùng Spodoptera frugiperda (Sf9)...............................47

3.4. Đồng chuyển nạp tạo baculovirus tái tổ hợp mang hộp gen m1 ...................48

3.5. Kiểm tra sự có mặt của gen m1 trong virus tái tổ hợp bằng phương pháp PCR

..........................................................................................................................52

3.6. Kiểm tra sự biểu hiện của protein M1 ở tế bào Sf9......................................53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................................56

DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN..............................57

TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................58

PHỤ LỤC..............................................................................................................65

LỜI CAM ĐOAN..................................................................................................68

Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu http://www.lrc.tnu.edu.vn/

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tên đầy đủ Nghĩa tiếng Việt

Amp Ampicillin Ampixilin

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

APS Amonium persulphate Amonium persunphat

ARN Ribonucleic Acid Axit ribonucleic

bp Base pair Cặp bazơ nitơ

BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết thanh bò

CPE Cytopathic effect Các tác động gây bệnh tế bào

CBB Comassie Brillant Blue Comassie Brillant Blue

dNTP 2’-deoxyribonucleoside 5’-

triphosphate

2’-deoxyribonucleozid 5’-

triphosphat

ĐC Lane Đường chạy

E.coli Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli

EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic

Acid

Axit ethylen diamin tetraaxetic

EtBr Ethidium Bromite Ethidium Bromit

HA Hemagglutinin Hemagglutinin

Kb Kilo base Kilo bazơ

KDa, Da Kilo Dalton, Dalton Kilo Dalton, Dalton

LB Lauria-betani medium Môi trường LB

LBA Lauria broth containing

ampicillin

Môi trường LB có bổ sung

ampixilin

mg Miligram Miligam

NA Neuraminidase Neuraminidase

ng Nanogram Nanogam

Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu http://www.lrc.tnu.edu.vn/

OD Optical density Mật độ quang học

PBS Phosphate Buffered Saline Đệm PBS

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

PVDF Polyvinylidene difluoride Polyvinylidin difluorit

RNA Ribonucleic acid Axít ribonucleic

RNP Ribonucleoprotein Ribonucleoprotein

SDS Sodium dodecyl sulphat Natri dodexin sunphat

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphat￾Polyacrylamid gel

electrophoresis

Điện di trên gel polyacrylamit có

chứa SDS

TAE Tris - Acetate – EDTA Tris - Acetat – EDTA

Taq Thermus aquaticus Vi khuẩn Thermus aquaticus

TBS Tris Buffered Saline Đệm Tris

TE Tris – EDTA Tris – EDTA

Soá hoùa bôûi Trung taâm Hoïc lieäu http://www.lrc.tnu.edu.vn/