Tạo tấm tế bào sụn từ sự kết hợp giữa tế bào gốc trung mô mỡ thỏ và màng chân bì da người

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-----------------

NGUYỄN XUÂN HOÀNG

TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ SỰ KẾT HỢP

GIỮA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MỠ THỎ

VÀ MÀNG CHÂN BÌ DA NGƯỜI

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2021

.

.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-----------------

NGUYỄN XUÂN HOÀNG

TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ SỰ KẾT HỢP

GIỮA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MỠ THỎ

VÀ MÀNG CHÂN BÌ DA NGƯỜI

NGÀNH: KHOA HỌC Y SINH (MÔ PHÔI)

MÃ SỐ: 8720101

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. TS. HUỲNH DUY THẢO

2. TS. TRẦN NGUYỄN QUỐC VƯƠNG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2021

.

.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được sự hướng dẫn

khoa học của TS. Huỳnh Duy Thảo và TS. Trần Nguyễn Quốc Vương. Các nội dung

nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực.

Những số liệu trong bảng biểu, đồ thị, hình ảnh phục vụ cho việc phân tích,

nhận xét, đánh giá được chính nhóm nghiên cứu của chúng tôi thu thập từ các nguồn

khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, trong luận văn còn sử

dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức

khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc.

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về

nội dung luận văn của mình.

TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2021

NGUYỄN XUÂN HOÀNG

.

.

MỤC LỤC

Trang

Danh mục chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục hình

Danh mục đồ thị

MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................4

1.1 Tổng quan về mô sụn........................................................................................................4

1.2 Quá trình sửa chữa tổn thương sụn................................................................................6

1.3 Các chiến lược điều trị trong phục hồi, sửa chữa tổn thương sụn khớp.................7

1.3.1 Nhóm can thiệp điều trị không có thành phần sinh học ................................8

1.3.2 Nhóm can thiệp điều trị có thành phần sinh học.............................................8

1.4 Kỹ nghệ mô trong sửa chữa và tái tạo mô sụn...........................................................10

1.4.1 Tổng quan và ứng dụng kỹ nghệ mô trong tái tạo mô sụn..........................10

1.4.2 Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ........................................................................15

1.4.3 Giá thể màng chân bì..........................................................................................22

1.5 Tình hình nghiên cứu ngoài nước ................................................................................23

1.6 Tình hình nghiên cứu trong nước.................................................................................24

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................27

2.1 Đối tượng nghiên cứu.....................................................................................................27

2.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu......................................................................................................27

2.3 Thiết kế nghiên cứu ........................................................................................................27

2.4 Y đức..................................................................................................................................27

2.5 Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................................27

2.5.1 Phân lập và định danh TBGTM từ mô mỡ thỏ..............................................27

2.5.2 Tạo tấm tế bào sụn từ TBGTM và giá thể màng chân bì da người...........33

2.5.3 Đánh giá tấm tế bào sụn.....................................................................................34

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..........................................................................35

.

.

3.1 Phân lập và nuôi cấy TBGTM từ mô mỡ ...................................................................35

3.1.1 Kết quả phân lập, nuôi cấy tăng sinh TBGTM từ mô mỡ...........................35

3.1.2 Đánh giá sự tăng sinh của TBGTM từ mỡ.....................................................37

3.2 Kết quả định danh TBGTM từ mỡ...............................................................................38

3.2.1 Khảo sát hình thái học và đặc tính bám dính.................................................38

3.2.2 Khảo sát khả năng biệt hóa ...............................................................................40

3.2.3 Khảo sát biểu hiện gien bằng phương pháp PCR .........................................42

3.2.4 Khảo sát biểu hiện gien cho các marker đặc trưng sụn bằng qRT-PCR. .46

3.3 Tạo tấm tế bào sụn từ sự kết hợp TBGTM từ mô mỡ thỏ với màng chân bì ......49

3.3.1 Kết quả đánh giá mô học ...................................................................................50

3.3.2 Kết quả chụp SEM..............................................................................................52

KẾT LUẬN.............................................................................................................................54

KIẾN NGHỊ..........................................................................................................55

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

.

.

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Từ Viết Tắt Tiếng Anh

ACI Autologous Chodrocyte Implementation

ADSC Adipose Derived Stem Cell

CS Cộng sự

DMEM/F12 Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12

EDTA Ethylene Diaminetetraacetic Acid

FBS Fetal Bovine Serum

H&E Hematocylin & Eosin

iPSCs Induced Pluripotent Stem Cells

ISCT International Society for Cellular Therapy

KHV Kính hiển vi

MACI Membrane-asociated ACI

PBS Phophate-Buffered Saline

qRT-PCR

Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain

Reaction

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

SEM Scanning Electron Microscopy

TBGTM Tế Bào Gốc Trung Mô

TEM Transmission Electron Microscopy

TGF-1 Transforming growth factor-1

.

.

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Tiêu chuẩn định danh TBGTM ............................................................. 21

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng RT-PCR.............................................................. 31

Bảng 2.3. Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR......................................................... 31

Bảng 2.4. Thành phầ khuếch đại các gien tạo sụn ................................................. .32

Bảng 2.5. Chu trình nhiệt phản ứng qRT-PCR....................................................... 32

Bảng 3.6. Mật độ tế bào thu nhận theo thời gian.................................................... 37

Bảng 3.7. So sánh các marker bề mặt giữa người và thỏ bằng Flow cytometry giữa

các nghiên cứu ...................................................................................................... 43

Bảng 3.8. So sánh các marker bề mặt bằng phương pháp RT-PCR giữa các nghiên

cứu ........................................................................................................................ 45

Bảng 3.9. Bảng số liệu mức độ biểu hiện gien theo thời gian................................. 46

.

.

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Phân bố sụn trong cơ thể .........................................................................5

Hình 1.2. Phân loại mô sụn .....................................................................................6

Hình 1.3. Các dạng tổn thương sụn .........................................................................7

Hình 1.4 Lược đồ phương pháp ACI .......................................................................9

Hình 1.5. Những tiến bộ trong kỹ nghệ mô............................................................ 12

Hình 1.6. Các thành phần chính của kỹ nghệ mô trong sửa chữa sụn .................... 13

Hình 1.7. Các nguồn tế bào gốc, nguồn thu nhận và đặc điểm của chúng .............. 14

Hình 1.8. Khả năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô ........................................... 16

Hình 1.9. Quy trình phân lập và nuôi cấy TBGTM từ mỡ ..................................... 18

Hình 2.10. Xử lý mẫu mô mỡ để thu nhận TBGTM............................................... 28

Hình 2.11. Một số loại môi trường được sử dụng để cảm ứng biệt hóa TBGTM thành

nguyên bào xương, nguyên bào sụn và tế bào mỡ.................................................. 29

Hình 3.12. Phân lập và nuôi cấy TBGTM từ mô mỡ ............................................. 36

Hình 3.13. Kết quả quan sát hình thái và đặc tính bám dính của TBGTM từ mô mỡ

dưới KHV đảo ngược 10X..................................................................................... 39

Hình 3.14. Kết quả đánh giá khả năng biệt hóa của TBGTM.. ............................... 41

Hình 3.15. Kết quả RT-PCR của các marker TBGTM ........................................... 43

Hình 3.16. Cấu trúc mô học nhuộm H&E và Safranin O của tấm tế bào sụn.......... 50

Hình 3.17. Kết quả nhuộm mô học tấm tế bào sụn từ sự kết hợp của TBGTM mỡ và

màng chân bì ........................................................................................................ 51

Hình 3.18. Cấu trúc mô học nhộm H&E của tấm tế bào sụn được đưa lên lần 2 .... 52

Hình 3.19. Kết quả chụp tấm tế bào sụn bằng KHV điện tử quét (SEM)................ 53

.

.