Tạo các hạt nanochitosan - tripolyphosphate có kích thước khác nhau bằng phương pháp liên kết ion và đánh giá hoạt tính đối kháng vi sinh vật của chúng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

1

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TRẦN THỊ KIM DUNG

TẠO CÁC HẠT NANOCHITOSAN-TRIPOLYPHOSPHATE CÓ KÍCH

THƢỚC KHÁC NHAU BẰNG PHƢƠNG PHÁP LIÊN KẾT ION VÀ ĐÁNH

GIÁ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CHÚNG

Ngành: Sinh học

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60.42.40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. PHẠM VIỆT CƢỜNG

Hà Nội - 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

2

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành đề tài luận văn thạc sĩ, bên cạnh sự nỗ lực cố gắng của bản

thân còn có sự hƣớng dẫn nhiệt tình của quý Thầy Cô, cũng nhƣ sự động viên ủng

hộ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian học tập nghiên cứu và thực hiện luận

văn thạc sĩ.

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Phạm Việt Cƣờng -

Phòng Công nghệ sinh học - Viện Hoá sinh biển- Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam, ngƣời đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn

thành luận văn này.

Đồng thời, tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kim Cúc cùng

các anh chị em trong Phòng Công nghệ sinh học - Viện Hoá sinh biển- Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên

cứu.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến toàn thể quý Thầy Cô trong bộ môn

Vi sinh vật học đã hết lòng truyền đạt những kiến thức quý báu cũng nhƣ tạo mọi

điều kiện thuận lợi nhất trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để cho tôi có thể

hoàn thiện đề tài.

Cuối cùng xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè, những ngƣời

đã không ngừng động viên, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt

thời gian học tập và thực hiện luận văn.

Hà Nội, Ngày tháng năm 2013

Học viên

Trần Thị Kim Dung

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

3

MỤC LỤC

trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT.............................................

DANH MỤC BẢNG .......................................................................................

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ...........................................................................

MỞ ĐẦU...........................................................................................................

Chƣơng 1 - TỔNG QUAN......................................................................................

1.1. Chitosan...........................................................................................................

1.1.1.Cấu trúc của chitosan................................................................................

1.1.2. Tính chất của chitosan..............................................................................

1.1.3. Cơ chế kháng khuẩn của Chitosan ...........................................................

1.1.4. Ứng dụng của chitosan trong các lĩnh vực khoa học công nghệ..............

1.2. Tổng quan về nano chitosan............................................................................

1.2.1. Các phương pháp chế tạo nano chitosan .................................................

1.2.2. Ứng dụng của hạt nano chitosan..............................................................

1.2.3. Hoạt tính kháng khuẩn của nano chitosan ...............................................

1.3. Các chủng vi sinh vật thử nghiệm...................................................................

1.3.1. Bacillus subtilis.........................................................................................

1.3.2. Bacillus cereus..........................................................................................

1.3.3. Micrococcus luteus ...................................................................................

1.3.4. Listonella damsela ....................................................................................

1.3.5. Candida albicans......................................................................................

1.3.6. Fusarium oxysporum ................................................................................

1.3.7. Aspergillus awamori Nakazawa ...............................................................

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

4

Chƣơng 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Hóa chất và dụng cụ thiết bị ...........................................................................

2.1.1. Hóa chất....................................................................................................

2.1.2. Dụng cụ.....................................................................................................

2.1.3. Thiết bị ......................................................................................................

2.1.4. Các chủng vi sinh vật thử nghiệm...........................................................

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................

2.2.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nano chitosan

bằng phương pháp liên kết ion.................................................................

2.2.1.1. Khảo sát ảnh hƣởng của khối lƣợng phân tử chitosan.....................

2.2.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ CS/TPP.............................................

2.2.1.3. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian khuấy, tốc độ khuấy...................

2.2.2. Tạo các loại hạt nano chitosan có kích thước khác nhau bằng phương

pháp liên kết ion ......................................................................................

2.2.3. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của các loại hạt nano chitosan có

kích thước khác nhau................................................................................

Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo hạt nano chitosan - TPP ....

3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan..............................

3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa CS và TPP ........................................

3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy và thời gian khuấy lên quá trình

tạo hạt nano chitosan ...............................................................................

3.2. Tạo các loại hạt nano chitosan có kích thƣớc khác nhau ................................

3.3. Đánh giá hoạt tính đối kháng vi sinh vật của các loại hạt nano chitosan có

kích thƣớc khác nhau (CF2: 1000 nm, CF1: 450 nm, CF6: 100 nm) ............

3.3.1. Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các loại hạt nano chitosan có kích

thước khác nhau........................................................................................

3.3.2. Đánh giá khả năng kháng nấm của các loại hạt nano chitosan có kích

thước khác nhau........................................................................................

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

5

3.3.2.1. Khả năng kháng nấm men Candida albicans của các loại hạt

nano chitosan.....................................................................................

3.3.2.2. Khả năng kháng nấm mốc của các loại hạt nano chitosan có kích

thƣớc khác nhau ................................................................................

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...........................................................................

TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................

PHỤ LỤC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

6

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

CF2 Hạt nanochitosan-tripolyphosphate kích thƣớc 1000nm

CF1 Hạt nanochitosan-tripolyphosphate kích thƣớc 450nm

CF6 Hạt nanochitosan-tripolyphosphate kích thƣớc 100nm

MIC90 Minimum Inhibitory concentration - Nồng độ ức chế tối thiểu

MBC Minimum bactericidal Concentration - Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

MFC Minimum Fungicidal Concentration - Nồng độ diệt nấm tối thiểu

OD Optical Density

DD Degree of Deacetylation (Độ deacetyl hóa)

DNA Deoxyribonucleic Acid

FE-SEM Field Emission Scanning Electron Microscopy (Kính hiển vi điện tử

quét phát xạ trƣờng)

TPP Tripolyphosphate

B.s Bacillus subtilis

M.lu Micrococcus luteus

V23 Bacillus cereus

V1 Listonella damsela

M15 Aspergillus awamori Nakazawa

F.oxys Fusarium oxysporum

C.ab Candida albicans

KLPTTB Khối lƣợng phân tử trung bình

CS Chitosan không xử lý

C5 Chitosan xử lý bằng lò vi sóng 600w/ 5 phút

C10 Chitosan xử lý bằng lò vi sóng 600w/ 10 phút

ηo : Độ nhớt đặc trƣng

M: Khối lƣợng phân tử trung bình

NMR: Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) - phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

cs: Cộng sự

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

7

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Tóm tắt phƣơng pháp điều chế hạt nano chitoan làm chất dẫn các loại

thuốc, protein hoặc gen khác nhau.............................................................

Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng MPA....................................................................

Bảng 2.2. Thành phần môi trƣờng Hansen ................................................................

Bảng 2.3. Thành phần môi trƣờng Czapek-Dox ........................................................

Bảng 3.1 : KLPTTB của Chitosan xử lý và không xử lý............................................

Bảng 3.2: Kích thƣớc hạt nano chitosan thu đƣợc ở các điều kiện khác nhau ..........

Bảng 3.3: Khả năng ức chế vi khuẩn của các hạt nanochitosan (%) .........................

Bảng 3.4: Giá trị MIC90 và MBC của các chế phẩm với các chủng vi khuẩn

nghiên cứu................................................................................................

Bảng 3.5: Khả năng ức chế Candida albicans của các hạt nanochitosan (%)

Bảng 3.6: Giá trị MIC90 và MFC của các chế phẩm với chủng Candida albicans....

Bảng 3.7: Khả năng ức chế nấm mốc của các hạt nanochitosan (%) ........................

Bảng 3.8: Giá trị MIC90 và MFC của các chế phẩm với các chủng nấm sợi

nghiên cứu..................................................................................................

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

8

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Quy trình thu nhận chitin và chitosan........................................................

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của chitin và chitosan...................................................

Hình 1.3 : Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp khâu mạch nhũ tƣơng...........................

Hình 1.4 : Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp giọt tụ, kết tủa ......................................

Hình 1.5 : Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp tạo giọt nhũ tƣơng ................................

Hình 1.6: Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp mixen đảo..............................................

Hình 1.7: Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp liên kết ion.............................................

Hình 1.8: Hình thái của Bacillus subtilis ...................................................................

Hình 1.9: Hình thái của Bacillus cereus.....................................................................

Hình 1.10: Hình thái của Micorcoccus luteus............................................................

Hình 1.11. Hình thái của Photobacterium damselae ...............................................

Hình 1.12. Hình thái của Candida albicans...............................................................

Hình 1.13. Hình thái của Fusarium oxysporum.........................................................

Hình 1.14. Hình thái của Aspergillus awamori Nakazawa ........................................

Hình 3.1: Kích thƣớc hạt nanochitosan với chitosan xử lý bằng lò vi sóng ..............

Hình 3.2: Kích thƣớc hạt nanochitosan với chitosan không xử lý.............................

Hình 3.3: Dung dịch nano chitosan điều chế từ các tỷ lệ CS/TPP khác nhau (từ

trái qua phải): 4:1, 5:1, 6:1.........................................................................

Hình 3.4: Kích thƣớc hạt nanochitosan với tốc độ khuấy1500v/2h...........................

Hình 3.5: Kích thƣớc hạt nanochitosan với tốc độ khuấy 4000v/2h..........................

Hình 3.6: Kích thƣớc hạt nanochitosan với tốc độ khuấy 8000v/2h..........................

Hình 3.7: Kích thƣớc hạt nanochitosan với tốc độ khuấy 8000v/1h..........................

Hình 3.8: Kích thƣớc hạt nanochitosan với tốc độ khuấy 8000v/3h..........................

Hình 3.9: Kích thƣớc hạt nanochitosan đƣợc báo cáo theo số lƣợng (a) và theo

cƣờng độ (b) của mẫu CF2.........................................................................

Hình 3.10: Điện thế zeta của hạt nanochitosan thu đƣợc từ mẫu CF2.......................

Hình 3.11. Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan của mẫu CF2 ........................................

Hình 3.12: Kích thƣớc hạt nanochitosan đƣợc báo cáo theo số lƣợng (c) và theo

cƣờng độ (d) của mẫu CF1.........................................................................