Tăng cường tính chống chịu và cải tiến chất lượng giống lúa bằng công nghệ sinh học thực vật

ViiÖn khoa häc

vµ c«ng nghÖ viÖt nam

Bé khoa häc

vµ c«ng nghÖ

ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc

18 Hoµng Quèc ViÖt, CÇu GiÊy, Hµ Néi

V.KHCNVN

V.CNSH

V.KHCNVN

V.CNSH

V.KHCNVN

V.CNSH

B¸o c¸o tæng kÕt §Ò tµi

Hîp t¸c Nghiªn cøu KH&CN víi n−íc ngoµi

Chñ nhiÖm ®Ò tµi: PGS. TS. Lª TrÇn B×nh

6288

25/01/2007

Hµ Néi, 2006

ViiÖn khoa häc

vµ c«ng nghÖ viÖt nam

Bé khoa häc

vµ c«ng nghÖ

ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc

----------------------------------

V.KHCNVN

V.CNSH

V.KHCNVN

V.CNSH

V.KHCNVN

V.CNSH

B¸o c¸o tæng kÕt §Ò tµi

Hîp t¸c Nghiªn cøu KH&CN víi n−íc ngoµi

T¨ng c−êng tÝnh chèng chÞu

vµ c¶i tiÕn chÊt l−îng gièng lóa b»ng

c«ng nghÖ sinh häc thùc vËt

Chñ nhiÖm §Ò tµi: PGS. TS. Lª TrÇn B×nh

C¬ quan chñ tr×: ViÖn C«ng nghÖ sinh häc

C¬ quan chñ qu¶n: ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam

Thêi gian thùc hiÖn: 2002 - 2005

Hµ Néi, 2006

Đề tài hợp tác Việt - Đức i

LLờờii ccảảmm ơơnn

Trong khuôn khổ hợp tác song phương về khoa học và công nghệ giữa

CHLB Đức và Việt Nam thì lĩnh vực công nghệ sinh học được chú trọng

như một lĩnh vực ưu tiên. Tuy nhiên, hầu hết các nội dung hợp tác giữa

các đối tác Việt Nam và đối tác Đức nổi bật vẫn là những nội dung nặng về

chuyển giao công nghệ và đào tạo nguồn nhân lực.

Lần đầu tiên trong lĩnh vực công nghệ sinh học có một đề tài mà cả hai bên

đối tác đều muốn tập trung khai thác những thành tựu mới nhất của thế

giới về Giải mã genom cây lúa nước. Đó cũng là lý do vì sao một quốc gia

như Đức, không trồng một cây lúa nước nào ở ngoài đồng ruộng tự nhiên

mà lại quan tâm đến những nghiên cứu rất cơ bản về cây lúa nước.

Vì thế việc xây dựng một đề tài đối ứng với một Viện đầu ngành về sinh

học phân tử thực vật như Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử,

Golm là một cơ hội lớn cho Viện Công nghệ sinh học nhằm học hỏi cách

thức tiếp cận tiến hành nghiên cứu khoa học tân tiến.

Chủ nhiệm đề tài xin trân thành cảm ơn Bộ Khoa học và Công nghệ, Viện

Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Bộ Liên bang về Đào tạo và nghiên

cứu, CHLB Đức đã hỗ trợ sự hợp tác này.

CƠ QUAN CHỦ TRÌ

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÓ VIỆN TRƯỜNG

PGS.TS. Trương Nam Hải

CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI

PGS. TS. Lê Trần Bình

Đề tài hợp tác Việt - Đức ii

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

ABA Abscisic axít

ADC Arginindecarboxylase

APS Ammonium persulfate

RNAse RNA polymerase

ATP Adenosine triphosphate

BSA Bovine serum albumin

Bc Bacillus cereus

bp base pair

Bt Bacillus thuringiensis

CaMV35S- P Cauliflower Mosaic Virus 35S Promotor

cDNA Complementary DNA

CHLB Cộng Hoà Liên Bang

CGS Cystathionin gamma-Synthase

cry Crystal gene = Gen mã hoá protein tinh thể độc tố diệt côn trùng của vi khuẩn

Bacillus thuringiensis

DNA Deoxyribonucleic axít

DAO Diaminoxidase

DNAse DNA polymerase

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

Et-Br Ethidium Bromide

FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer

GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry

GC-TOF-MS Gas Chromatograph/time-of-flight mass spectrometers

GCN Guanidium thiocyanate

GUS β-Glucuronidase gene = gen mã hoá β-Glucuronidase

HSK Homoserine kinase

HPLC High Performance Liquid Chromatography = sắc ký lỏng cao áp

IRRI International Rice Research Institute = Viện nghiên cứu lúa Quốc tế

IPTG Isopropylthio-o-D-galactoside

Kb Kilobase

KDa Kilo dalton

KN&CN Khoa học và Công nghệ

Km Kanamycine

KO Knock out

LB Luria và Bertani

mRNA Messenger RNA

MPI Viện Sinh lý Phân tử thực vật Max - Planck

Đề tài hợp tác Việt - Đức iii

MS Môi trường nuôi cấy theo Murashige & Skoog

MST Mass Spectral Target = Chất mục tiêu

NCS Nghiên cứu sinh

NhaA Na+/H+ antiporter

NOS-P Nopaline Synthase Promotor

nptII Neomycine phosphotransferase II gene=Gen mã hoá neomycine

phosphotransferase II

OAT Ornithine Aminotransferase

OD Optical density

PA Polyamin

PAM Chlorophyll Fluorometers to measuring systems of plant Gas Exchange = Hệ

thống đo huỳnh quang diệp lục

PAO Polyaminoxidase

PCR Polymerase Chain Reaction

PGS.TS Phó Giáo sư. Tiến sĩ

QA, QB Quinon A, Quinon B

RNA Ribonucleic axít

RT-RT-PCR Real Time-Reverse Trascription-Polymerase Chain Reaction = PCR định lượng

SAMDC S-Adenosylmethionin-decarboxylase

SAT Serine acetyltransferase

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis = Điện di biến tính

trên gel polyacrylamide

SPD Spermidinsynthase

T-DNA Transfer-DNA = DNA chuyển

TF Transcription factor = Yếu tố điều khiển phiên mã

Ti-plasmit Tumor inducing plasmid = Plasmit gây khối u thực vật

Vip Vegetative insecticidal protein = protein sinh dưỡng diệt côn trùng

Vir Virulence Region = Vùng gây độc có khả năng tạo khối u

X-gal 5-bromo-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase

X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

Đề tài hợp tác Việt - Đức iv

MỤC LỤC

BÀI TÓM TẮT .......................................................................................................................... 1

LỜI MỞ ĐẦU …………………………………………………………………………………………. 4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ………... 5

1.1. Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước ………………………………………………………. 5

1.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước ………………………………………………………. 6

1.3. Mục tiêu của đề tài .......................................................................................................... 7

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………………....................... 8

2.1. Đối tượng và thiết bị nghiên cứu ................................................................................... 8

2.1.1. Các giống lúa ........................................................................................................... 8

2.1.2. Các thiết bị chính ..................................................................................................... 9

2.2. Nội dung nghiên cứu …………………………..............................................................… 9

2.2.1. Tìm kiếm và phân lập các gen làm gia tăng hàm lượng polyamin thông qua kỹ

thuật ức chế gen bằng RNA ……………………………………………………………. 9

2.2.2. Phát hiện các gen điều khiển tính chịu hạn và muối bằng phổ phiên mã RNA .............. 10

2.2.3. Kỹ thuật sao chép gen …………………………………………………………………… 10

2.2.4. Kỹ thuật phân tích phổ chất bằng sắc ký khí/quang phổ khối .................................. 11

2.2.5. Tối ưu phương pháp chuyển gen vào một số giống lúa Việt Nam ........................... 11

2.3. Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………………………………. 12

2.3.1. Phương pháp sinh lý học thực vật ……………………………………………………… 12

2.3.2. Phươn g pháp sinh học phân tử thực vật ……………………………………………… 18

2.3.3. Phương pháp phân tích …………………………………………………………………. 22

2.3.4. Phương pháp biến nạp gen vào cây lúa ………………………………………………. 23

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ………………………………………………………… 31

3.1. Vai trò của Polyamin đối với tính chịu hạn và chịu mặn ……………………………..... 31

3.1.1. Đánh giá tính chịu mặn ………………………………………….............................…. 31

Đề tài hợp tác Việt - Đức v

3.1.2. Đánh giá tính chịu hạn......……………………………………………………………….. 32

3.1.3. Phân tích polyamin và biểu hiện gen …………………………………………………... 35

3.2. Xác định gen điều khiển mới kiểm soát tính chịu mặn và chịu hạn ........................... 39

3.2.1. Thiết lập …………………………………………………………………………………… 39

3.2.2. Xây dựng phương pháp ........................................................................................... 41

3.2.3. Xử lý hạn .................................................................................................................. 41

3.2.4. Xử lý muối ................................................................................................................ 41

3.2.5. Xây dựng ngân hàng dữ liệu về Tác nhân phiên mã ở lúa ...................................... 47

3.3. Các chất trao đổi trong rễ ở trạng thái ổn định và chuyển trạng thái khi bị xử lý stress ....... 47

3.3.1. Xây dựng phương pháp nuôi trồng và chuyển gen lúa ở các giống thuộc loài phụ Indica … 47

3.3.2. Xử lý hạn ………………………………………………………………………………….. 47

3.3.3. Xử lý muối ………………………………………………………………………………… 48

3.3.4. Thiết lập một ngân hàng các chất trao đổi của lá và rễ lúa khi phân tích phổ …….. 48

3.3.5. Xác định bằng khối phổ các chất chưa biết ............................................................. 49

3.3.6. Xác định và phân tích chất chỉ thị khi xử lý mặn ...................................................... 50

3.3.7. Phân tích tương quan trong xác định chất chỉ thị …………………………………….. 51

3.3.8. Đề xuất bổ sung ....................................................................................................... 55

3.4. Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.................................... 55

3.4.1. Chuyển gen tăng cường khả năng chịu hạn và mặn ............................................... 55

3.4.2. Chuyển gen cải thiện thành phần aminoacid trong lúa gạo ..................................... 56

3.4.3. Đề xuất bổ sung ....................................................................................................... 66

CHƯƠNG 4. TỔNG QUÁT HOÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC................................ 68

41. Kết quả về khoa học ......................................................................................................... 68

4.2. Kết quả nổi bất và khả năng áp dụng ............................................................................ 70

4.3. Trình độ công nghệ ......................................................................................................... 72

4.4. Khả năng áp dụng ........................................................................................................... 72

4.5. Đào tạo ............................................................................................................................. 74

4.6. Sản phẩm khoa học của đề tài ...................................................................................... 75

Đề tài hợp tác Việt - Đức vi

4.7. Hợp tác quốc tế ............................................................................................................... 76

4.8. Tình hình sử dụng kinh phí ............................................................................................ 76

4.9. Danh sách các công trình công bố ................................................................................ 77

4.10. Hạn chế của đề tài ......................................................................................................... 78

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................... 79

5.1. Kết luận ............................................................................................................................ 79

5.2. Đề nghị ............................................................................................................................. 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................ 82

PHỤ LỤC ĐỀ TÀI 83

Báo cáo tình hình sử dụng và Quyết toán kinh phí

Bản thuyết minh đề cương đề tài

Quyết định của Bộ trưởng về việc phê duyệt các nhiệm vụ hợp tác khoa học

Công văn gia hạn sử dụng kinh phí đề tài

Quyết định thành lập và Biên bản đánh giá của Hội đồng nghiệm thu cấp Cơ sở

Các báo cáo khoa học đăng trên tạp chí trong nước

Các báo cáo khoa học đăng trên tạp chí quốc tế

Poster

Danh sách các gen tìm được trong ngân hàng các dòng KO

So sánh trình tự các gen thiết kế với Genbank

Danh sách các giống lúa làm nguyên liệu

Trang web Ngân hàng dữ liệu về tác nhân phiên mã ở lúa

Trang web của Viện IRRI - Phân loại khả năng chống chịu của các giống lúa theo tiêu

chuẩn của IRRI

Đề tài hợp tác Việt - Đức vii

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 2.1: Các giống lúa được sử dụng trong các nghiên cứu đề tài co nguồn gốc từ

các quốc gia khác nhau, chủ yếu là các giống của Việt Nam ...................... 8

Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy trong chuyển gen thông qua

Agrobacterium tumefaciens …………………………………………………………………. 26

Bảng 3.1: Kết quả đánh giá tính chịu mặn của các giống lúa tham gia thí nghiệm tổng

hợp theo IRRI trong điều kiện sử dụng nồng độ muối là 100mM NaCl (5,8

g/l), thí nghiệm 3 lần với 5 lần nhắc lại …………………………………………………. 31

Bảng 3.2: Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lúa. Thí nghiệm với 5

lần nhắc lại. Nhóm được phân theo mức 30% và 70% chênh lệch …………… 33

Bảng 3.3: Kết quả xử lý hạn nhẹ kéo dài và xử lý hạn khắc nghiệt …………………………. 53

Bảng 3.4: Kết quả chọn lọc và tái sinh cây lúa chuyển gen nhaA ……………………………. 55

Bảng 3.5: Tiến độ chuyển các gen cải thiện chất lượng amino acid gồm Cystathionin

gamma-Synthase (CGS), Serinacetyltransferase (SAT), Homoserinkinase

(plastid, SSUHSK), Homoserinkinase (cytosolic, HSK) và Glucoronidase

(GUS) của gạo vào cây lúa …………………………………………………………………… 58

Bảng 3.6: Điều kiện thuỷ phân protein bằng lò vi sóng MAR5 …………………………………. 64

Bảng 4.1: Báo cáo tóm tắt kết quả thực hiện từ 12/2001 - 12/2005 ……………………….. 70

Bảng 4.2: Khả năng áp dụng của đề tài ……………………………………………………………….. 72

Bảng 4.3: Danh sách các học viên được đào tạo …………………………………………………… 74

Bảng 4.4: Danh sách các cán bộ được nâng cao trình độ ………………………………………. 74

Bảng 4.5: Nội dung hợp tác quốc tế …………………………………………………………………….. 76

Bảng 4.6: Tình hình sử dụng kinh phí ………………………………………………………………….. 76

Đề tài hợp tác Việt - Đức viii

MỤC LỤC HÌNH

Hình 2.1: Hiện tượng dịch chuyển điện tử quang hợp trong các tâm phản ứng của hệ

quang hóa II …………………………………………..…………………………………………… 14

Hình 2.2: Nguyên lý cường độ phát quang ……………………………………………………………… 18

Hình 2.3: Sản phẩm PCR tăng dần theo chu kỳ phản ứng ………………………………………… 19

Hình 2.4: Mẫu dò lai …………… ………………………………………………………………………………. 20

Hình 2.5: Mẫu dò thủy phân (TaqMan probe) …………………………………………………………. 20

Hình 2.6: Định lượng (I), xác định đột biến với hybrydzation probes (II), xác định đột

biến với TaqMan probes (III), Định tính ví dụ xác định gen nào thuộc loài

nào (IV) ………………………………………………………………………………………………… 21

Hình 2.7: Cấu trúc vector pCAMBIA1300 dùng để thiết kế gen nhaA, OAT 21

Hình 2.8: Cấu trúc vector pCAMBIA1390/Ubill dùng để thiết kế gen CGS 22

Hình 2.9: Phân tích protein tổng số ........................................................................... 22

Hình 2.10: Sơ đồ các bước chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens ……….. 23

Hình 3.1: Sơ đồ các bước chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.. 32

Hình 3.2: Các giống lúa được trồng trong phytotron.................................................... 32

Hình 3.3: Lượng nước mất đi ở mỗi cây/ 1 ngày ......................................................... 33

Hình 3.4: Sự biến động về số nhánh/ cây, chiều dài lá, trọng lượng tươi, khô của các

giống ........................................................................................................

34-

35

Hình 3.5: Hàm lượng Putresine ở các giống xử lý mặn................................................. 35

Hình 3.6: Hàm lượng Spermidine và Spermine ở các giống xử lý mặn........................... 36

Hình 3.7: Hàm lượng Putresine, Spermidine và Spermine ở các giống xử lý hạn ........... 37

Hình 3.8: Hàm lượng Putresin đo được trong mẫu lá các giống lúa và sự thay đổi của

chúng khi xử lý sau 14 ngày với các nống độ NaCl tăng dần từ 0 lên 50 và

100 mM .................................................................................................... 38

Hình 3.9: Biểu hiện của gen Arginindecarboxylase (ADC) trong 7 giống lúa có mức độ

chịu mặn khác nhau..................... ……………………………………………………………. 39

Hình 3.10: Hiệu quả hoạt động của các cắp mồi dùng trong phản ứng RT-PCR khi nhân

những đoạn gen điều khiển bằng RNA tách chiết từ lúa ............................... 39

Đề tài hợp tác Việt - Đức ix

Hình 3.11: Độ nhạy của phản ứng RT-RT-PCR với các mẫu RNA thu được từ thân (trái)

và rễ (phải) cây mạ ................................................................................... 40

Hình 3.12: Đánh giá mức độ biểu hiện của gen điều khiển liên quan đến tính chịu mặn

trong cây lúa bằng kỹ thuật RT-RT-PCR với 6 cặp mồi đặc hiệu thiết kế theo

số liệu thu được từ ngân hàng gen cây lúa .................................................. 40

Hình 3.13: Kiểm tra đánh giá chất lượng các cặp mồi dùng cho phản ứng mức độ

đặc hiệu và hiệu quả nhân các đoạn gen điều khiển bằng cDNA từ

RNA cây mạ. Biểu đồ phản ứng theo thời gian ...................................... 41

Hình 3.14: Kiểm tra đánh giá chất lượng các cặp mồi dùng cho phản ứng mức độ

đặc hiệu và hiệu quả nhân các đoạn gen điều khiển bằng cDNA từ

RNA cây mạ. Biểu đồ tốc độ phản ứng .................................................. 42

Hình 3.15: Hiệu quả hoạt động của các cặp mồi chuyên dụng dùng trong phản ứng RT￾RT-PCR khi đánh giá mức độ biểu hiện của các gen điều khiển bằng RNA

tách chiết từ hai giống lúa khi xử lý mặn ..................................................... 43

Hình 3.16: Tần suất lặp lại của kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của các gen điều

khiển bằng RNA tách chiết từ hai giống lúa khi xử lý nặm bằng phản ứng RT￾RT-PCR khi đánh giá .................................................................................. 43

Hình 3.17: Sự phân bố tần xuất gen „cảm ứng do tiếp xúc“ ở các giống lúa tham gia thí

nghiệm tại điều kiện đối chứng không có muối vào thời điểm 30&180 phút ... 44

Hình 3.18: Sự phân bố tần xuất gen chịu tác động „cảm ứng“ và „ức chế“ bởi tác động

của mặn ở các giống lúa tham gia thí nghiệm tại điều kiện có muối (100 mM)

vào thời điểm 30 và 180 phút............................................. ........................ 45

Hình 3.19: Mức độ biểu hiện của những gen điều khiển hoạt động có tính đặc thù riêng

của giống khi chịu tác động mặn …………………………………………………………….. 46

Hình 3.20: Tác động của mặn (NaCl) lên độ dẫn điện của dịch bào ở cây mạ hai giống

DR2 và Chàm khi bị xử lý các thời gian khác nhau từ 0 đến 24 h .................. 47

Hình 3.21: Kho dữ liệu các phổ nhân tạo của các chất trao đổi từ cây mạ (lúa nước) xác

định bằng phương pháp GC-TOF-MS làm nguồn so sánh (bên trái) và phổ

GC-TOF-MS của một mẫu đại diện (bên phải) .............................................. 49

Hình 3.22: Glycine N,N-di(trimethylsilyl) -, trimethylsilyl ester được đánh dấu tại vị trí

C1 và C2 với đồng vị nặng 13C, cũng như tại vị trí C2 với hai nguyên tử

Deuteri (D). .............................................................................................. 50

Hình 3.23: Biến động của hàm lượng Putrescine và Spermidine trong 4 giống lúa đối

chứng...............…………………………………………………………………………………….. 51

Hình 3.24: Sự thay đổi về hiệu suất quang hợp của hệ thống quang hoá II trong điều

kiện xử lý hạn nhẹ kéo dài ......................................................................... 52

Đề tài hợp tác Việt - Đức x

Hình 3.25: Sự thay đổi về hiệu suất quang hợp của hệ thống quang hoá II trong điều

kiện xử lý hạn khắc nghiệt ......................................................................... 53

Hình 3.26: Sự thay đổi về hiệu suất quang hợp của hệ thống quang hoá II tại các ngày

0, 4, 5, 6, 7, 8 rút nước để hạn .................................................................. 54

Hình 3.27: Kết quả đo hiệu suất quang hợp (PAM) đối với mảnh lá của các giống lúa có

mức độ chịu muối khác nhau theo thời gian xử lý tăng dần nồng độ NaCl …… 54

Hình 3.28: Kết quả chọn lọc và tái sinh cây lúa C71 chuyển gen nhaA ........................... 56

Hình 3.29: Kết quả sàng lọc cây chuyển gen OAT bằng PCR ......................................... 56

Hình 3.30: Sơ đồ vector chuyển gen pCAMBIA1390/Ubiqutin/SAT/HSK/CGS ................... 57

Hình 3.31: Qui trình chuyển gen vào lúa giống Tapei .................................................... 57

Hình 3.32: Kết quả sàng lọc cây chuyển gen bằng PCR với mồi đặc hiệu cho gen CGS

được chuyển............ ................................................................................. 59

Hình 3.33: Phổ 23 axit amin chuẩn xác định bằng RP HPLC .......................................... 61

Hình 3.34: Phổ các hợp chất thiols chuẩn xác định bằng RP HPLC ................................. 62

Hình 3.35: Chu trình trao đổi chất methionine và các gen tham gia ............................... 62

Hình 3.36: Các mẫu RNA tổng số sau khi xử lý DNAse, không nhận được sự khuyếch đại

nào sau 35 chu kỳ phản ứng ...................................................................... 63

Hình 3.37: Nguyên tắc phân tích axit amin tổng số từ protein ....................................... 64

Hình 3.38: Thành phần amino acid của protein chuẩn BSA và của protein gạo toàn

phần.......................................................................................................... 65

Hình 3.39: Kết quả chiết rút protein gạo bằng các dịch đệm khác nhau và phân tích trên

điện di PAGE (trên) và định lượng bằng Bradford (dưới)................................ 66

Đề tài hợp tác Việt - Đức xi

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN CHÍNH

STT Họ và tên Học hàm,

học vị Cơ quan

1 Lê Trần Bình PGS.TS Viện Công nghệ sinh học

2 Nông Văn Hải PGS.TS Viện Công nghệ sinh học

3 Trần Phương Liên TS Viện Công nghệ sinh học

4 Lê Thị Thu Hiền TS Viện Công nghệ sinh học

5 Phan Văn Chi PGS.TS Viện Công nghệ sinh học

6 Nguyễn Thu Hà ThS Viện Công nghệ sinh học

7 Nguyễn Thị Tỵ CN Viện Công nghệ sinh học

9 Lê Xuân Đắc ThS Viện Công nghệ sinh học

10 Lê Văn Sơn TS Viện Công nghệ sinh học

11 Nguyễn Phương Thảo ThS Viện Công nghệ sinh học

12 Nguyễn Thị Hồng Châu ThS Viện Công nghệ sinh học

13 Ellen Zuther TS Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử

14 A. Heyer TS Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử

15 Bernd Müller-Röber TS Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử

16 Joachim Kopka TS Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử

17 L. Willmitzer GS.TS Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử

18 Rainer Höfgen TS Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử

19 Nguyễn Hữu Cường NCS Viện CNSH tại Viện MP và SLTVPT

20 Đỗ Thị Phúc NCS Trường ĐHKHTN tại Viện MP và SLTVPT

DANH SÁCH CÁC CƠ QUAN PHỐI HỢP THỰC HIỆN

STT Cơ quan phối hợp Nội dung phối hợp

1 Đại học Tổng hợp Greifswald Đào tạo NCS

2 Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử Đào tạo NCS, nâng cao trình độ cán bộ

khoa học, trao đổi và phân tích mẫu

1

BÀI TÓM TẮT

Đề tài “Tăng cường tính chống chịu và cải tiến chất lượng giống lúa bằng

công nghệ sinh học thực vật” được thực hiện phối hợp giữa Viện Công nghệ sinh

học, Việt Nam với Viện Max Planck về Sinh học Phân tử thực vật, CHLB Đức do sự

chủ trì của PGS.TS. Lê Trần Bình nhằm mục tiêu nâng cao tính chống chịu và cải

tiến chất lượng giống lúa bằng công nghệ sinh học thực vật.

Trong khuôn khổ nghiên cứu, đề tài được thực hiện và thu được những kết quả

chính sau đây:

Các kết quả nghiên cứu khoa học

1. Bộ sưu tập 68 giống lúa chịu hạn và chịu mặn của Việt Nam đang được nhân

và lưu giữ tại Viện Công nghệ sinh học.

2. Tổng số 33 giống lúa trong đó có 29 giống Indica có nguồn gốc từ Việt Nam

và 4 giống Japonica đối chứng được đưa vào nghiên cứu đánh giá khả năng

chịu hạn và chịu mặn thông qua đánh giá các chỉ tiêu sinh lý, xác định hàm

lượng polyamin; mối tương quan giữa hàm lượng polyamin và khả năng

chống chịu hạn, mặn; đánh giá mức độ biểu hiện các gen điều khiển các gen

cảm ứng khi xử lý hạn và mặn, các chất trao đổi trong rễ và trong lá.

3. Hoàn thiện và tối ưu hóa phương pháp xử lý tính chịu muối và hạn đối với các

giống lúa phù hợp với điều kiện ở Việt Nam. Kết quả xử lý mặn thu được 5

giống chịu mặn tốt (Chăm, Chăm biển, IR57311, Cườm và Nước mặn), 7

giống chịu mặn trung bình (CR203, Nước mặn 1, Đốc đỏ, Nếp mặn, Đốc

phụng, C71 và Cha va) và 6 giống mẫn cảm (C70, DR2, Lúa mặn, Songhua,

Taipei và Nipponbare). Kết quả xử lý hạn thu được 7 giống chịu hạn khá tốt

(CR203, Khẩu chăm, Trà lĩnh, IR57311, C70, LC-93-1 và Nếp mèn), 7 giống

chịu hạn trung bình (LC-93-4, Cườm, C71, Taipei, Lúa mặn, Lốc dâu, K.lúa

nương) và 7 giống mẫn cảm (DR2, LC-93-2, Lốc, Khẩu nón, Khẩu hom,

Songhua, Nipponbare).

4. Kết quả xử lý mặn cho thấy (i) Giữa các nhóm có sự khác biệt rất rõ về hàm

2

lượng polyamin, (ii) Các giống mẫn cảm có hàm lượng Putrescine cao hơn hẳn,

(iii) Hàm lượng Putrescine tỷ lệ thuận với khả năng chịu mặn, (iv) Hàm lượng

Putrescine tăng lên khi xử lý với nồng độ NaCl tăng dần. Hoạt động của enzym

Arginindecarboxylase (ADC) ở những giống mẫn cảm tăng lên rất rõ rệt. Thí

nghiệm chuyển các gen chủ chốt làm thay đổi hàm lượng polyamin đang được

tiến hành.

5. Một ngân hàng dữ liệu về các gen điều khiển phiên mã (TF) với 2512 gen

gồm 2261 loci mã hóa và sắp xếp thành 44 họ gen khác nhau, được hoàn

thành và công bố trên http://ricetfdb.bio.uni-potsdam.de. Thông qua việc thiết

kế hàng trăm cặp mồi đặc hiệu và tiến hành kỹ thuật RT-RT-PCR đã đánh giá

được mức độ biểu hiện của các đoạn gen điều khiển khi cây mạ bị xử lý mặn

tại hai thời điểm. Kết quả cho thấy: với giá trị abs(log2(FoldChange))>3.32 và

hệ số biến đổi đạt khoảng 10 lần hoặc kích thích hoặc ức chế thì ở hai giống

nghiên cứu là Chàm và DR2 có đến 12%, tức là 313 gen trong số 2512 gen

được coi là cảm ứng hoặc ức chế do mặn.

6. Đối với cây mạ, 132 MSTs đã được xác định. Trong đó có 109 chất thuộc các

chất trao đổi sơ cấp, một số chất bị biến đổi thành 2 hoặc nhiều dẫn xuất hóa học

do hóa chất sử dụng trong kỹ thuật GC-MS. Tuy nhiên, 148 MSTs của cây mạ

chưa được xác định. Khẳng định được những chất trao đổi như Spermidine và

Putrescine trong rễ và lá lúa khi bị xử lý hạn và mặn có những thay đổi rất đáng

kể.

7. Hệ thống nuôi cấy mô tế bào để chuyển gen vào lúa với nguồn vật liệu ban

đầu là hạt lúa chín (thay vì phôi non rất khó chủ động) đã được thiết lập.

Chuyển được gen CGS và các gen khác như Serinacetyltransferase,

Homoserinkinase và Homoserinkinase (cytosolic) nhằm cải thiện thành phần

axít amin trong gạo của các giống lúa Việt Nam đang được thực hiện. Bước

đầu thu được các dòng cây chuyển gen phục vụ cho các phân tích tiếp theo.

8. Để có thể định lượng chính xác thành phần axít amin trong gạo, phương pháp

thủy phân protein tổng số của hạt gạo bằng vi sóng được hoàn thiện kết hợp

với việc tách chiết bằng các hệ dịch đệm khác nhau cho phép hình thành một

hệ thống gồm nghiền chiết protein từ gạo, thủy phân bằng vi sóng, tạo dẫn

xuất và định lượng với HPLC cho phép phân tích được hàm lượng axít amin

trong lượng siêu nhỏ (mg) bột gạo.