Tần suất một số GEN mã hóa yếu tố độc của Escherichia coli sinh B - Lactamase phổ mở rộng phân lập từ máu, mủ và nước tiểu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

--------∞0∞--------

NGUYỄN THỊ KIM QUYÊN

TẦN SUẤT MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ

ĐỘC CỦA Escherichia coli SINH

β- LACTAMASE PHỔMỞ RỘNG PHÂN LẬP TỪ

MÁU, MỦ VÀ NƯỚC TIỂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

--------∞0∞--------

NGUYỄN THỊ KIM QUYÊN

TẦN SUẤT MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ

ĐỘC CỦA Escherichia coli SINH

β- LACTAMASE PHỔ MỞ RỘNG PHÂN LẬP TỪ

MÁU, MỦ VÀ NƯỚC TIỂU

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số chuyên ngành: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS. PHAN THỊ PHƯỢNG TRANG

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: NGUYỄN THỊ KIM QUYÊN

Ngày sinh: 24/05/1980 Nơi sinh: Tây Ninh

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã học viên: 1884202010014

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin luận văn tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho

Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Thư viện trường đại học Mở

Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin luận văn tốt nghiệp vào hệ thống

thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

Ký tên

(Ghi rõ họ và tên)

Nguyễn Thị Kim Quyên

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ

CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: PGS. TS. PHAN THỊ PHƯỢNG TRANG

Học viên thực hiện: NGUYỄN THỊ KIM QUYÊN Lớp: MBIO18B

Ngày sinh: 24/05/1980. Nơi sinh: Xã Long Thuận, huyện Bến Cầu, tỉnh Tây Ninh.

Tên đề tài: “TẦN SUẤT MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ ĐỘC CỦA Escherichia coli

SINH β- LACTAMASE PHỔ MỞ RỘNG PHÂN LẬP TỪ MÁU, MỦ, VÀ NƯỚC

TIỂU”

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép học viên………………………………..

được bảo vệ luận văn trước Hội đồng:.......................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

....................................................................................................................................................

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 12 năm 2021.

Người nhận xét

PGS. TS. PHAN THỊ PHƯỢNG TRANG

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan rằng luận văn “TẦN SUẤT MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU

TỐ ĐỘC CỦA Escherichia coli SINH β- LACTAMASE PHỔ MỞ RỘNG PHÂN

LẬP TỪ MÁU, MỦ VÀ NƯỚC TIỂU” là bài nghiên cứu của chính tôi.

Ngoại trừ những tài liệu tham khảo được trích dẫn trong luận văn này, tôi cam

đoan rằng toàn phần hay những phần nhỏ của luận văn này chưa từng được công bố

hoặc được sử dụng để nhận bằng cấp ở những nơi khác.

Không có sản phẩm/nghiên cứu nào của người khác được sử dụng trong luận

văn này mà không được trích dẫn theo đúng quy định.

Luận văn này chưa bao giờ được nộp để nhận bất kỳ bằng cấp nào tại các

trường đại học hoặc cơ sở đào tạo khác.

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2021

Nguyễn Thị Kim Quyên

ii

LỜI CẢM ƠN

Em đặc biệt cảm ơn Cô PGS. TS Phan Thị Phượng Trang đã tận tình hướng

dẫn, chỉ dạy em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Cô cũng là người đặt nhiều tâm

huyết hơn ai hết giúp em thêm tự tin hoàn thành luận văn này một cách tốt nhất.

Em gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô NCS Nguyễn Lý Hoàng Ngân trong thời

gian thực hiện đề tài. Cô đã nhiệt tình chia sẻ và truyền đạt những kiến thức thực tế

vô cùng quý giá để nội dung của luận văn này hoàn chỉnh hơn. Chân thành cảm ơn

sự giúp đỡ nhiệt tình của em NCS Tinh Tươm giúp chị hoàn thành tốt nhất luận văn

này.

Em chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ từ Ban Giám hiệu, Quý Thầy, Cô

khoa Công Nghệ Sinh Học và Quý Thầy Cô khoa Đào Tạo Sau Đại Học trường Đại

học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy bảo, truyền đạt những kiến thức, kinh

nghiệm trong suốt thời gian qua. Đồng thời, cảm ơn Ban Lãnh đạo Trung tâm Khoa

học và Công nghệ Sinh học (CBB) - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố

Hồ Chí Minh, Ban lãnh đạo Viện Y tế công cộng thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều

kiện cho em học tập, thực hiện và hoàn thành luận văn thạc sĩ.

Chân thành cảm ơn những người bạn đã đồng hành và chia sẻ cùng Quyên

những kiến thức mà chúng ta lĩnh hội được trong suốt quá trình học tập.

Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình đã luôn là điểm tựa vững chắc cho em trong

bất cứ hoàn cảnh nào.

Trân trọng cảm ơn!

Nguyễn Thị Kim Quyên

iii

TÓM TẮT

E. coli mang gen kháng kháng sinh β-lactamase phổ mở rộng (ESBL) hiện là

mối quan tâm hàng đầu của y tế công cộng. Hiện tại đã có nhiều nghiên cứu về E.

coli sinh ESBL phân lập từ người lành và bệnh phẩm. Tuy nhiên, nghiên cứu về E.

coli sinh ESBL phân lập từ bệnh phẩm và đồng thời mang gen mã hóa yếu tố độc lực

ở Việt Nam chưa được tiến hành. Vì vậy, nghiên cứu này sẽ xác định tần suất một số

gen mã hóa yếu tố độc lực của E. coli sinh ESBL phân lập từ bệnh phẩm tại Bệnh

viện Bình Dân, TP. Hồ Chí Minh bằng cách sử dụng phương pháp cắt ngang, mô tả

cùng kỹ thuật multiplex-PCR và monoplex-PCR với các cặp mồi đặc hiệu để phát

hiện 16 gen mã hóa yếu tố độc: fimH, fyuA, iutA, PAI, kpsMTII, papC, hlyA,

kpsMTK1, ompT, hlyF, iroN, ireA, ibeA, sfa, iss và cvaC của 127 chủng phân lập từ

các loại bệnh phẩm khác nhau. Kết quả phân tích cho thấy, không có sự khác biệt về

tần suất 16 gen quan tâm giữa các nhóm bệnh nhân đến từ khu vực TP. Hồ Chí Minh

và các khu vực khác, cũng như không có sự khác biệt về tần suất tìm thấy các gen

này trong các chủng phân lập từ nhóm bệnh nhân nam và nữ. 4 gen fyuA, iutA, PAI,

fimH chiếm tỷ lệ cao nhất trong cả 3 loại bệnh phẩm nên có thể dùng làm gen chỉ dấu

cho các chủng ExPEC. Khác biệt về tần suất của các gen papC, ibeA, kps MTII giữa

các chủng phân lập từ 3 loại bệnh phẩm có ý nghĩa thống kê. Các chủng E. coli sinh

ESBL phân lập từ máu thường mang 6 – 7 gen mã hóa yếu tố độc, trong khi các chủng

từ mẫu mủ và nước tiểu thường mang 4 – 7 gen. Có đến 42 kiểu tổ hợp gen mã hóa

yếu tố độc khác nhau được phát hiện trong các chủng. Chủng mang nhiều nhất là 12

gen, phân lập từ mẫu nước tiểu. Nghiên cứu này đã phản ánh phần nào mức độ phổ

biến của các chủng ExPEC và tiềm năng gây bệnh của chúng.

iv

ABSTRACT

ESBL-producing E. coli carrying virulence genes is a concern for public health

and studies on these strains isolated from clinical specimens is lacking. Because of

that, this study aims to determine the prevalence of ESBL-producing E. coli carrying

virulence genes isolated from clinical specimens in Ho Chi Minh city. A prospective,

cross-sectional study was conducted in Binh Dan hospital with a total of 127 isolated

from clinical specimens were tested for 16 virulence genes including: fimH, fyuA,

iutA, PAI, kpsMTII, papC, hlyA, kpsMTK1, ompT, hlyF, iroN, ireA, ibeA, sfa, iss and

cvaC by 4 multiplex-PCR sets and 3 monoplex-PCR with specific primers. The

analysis results showed that there was no difference in the frequency of 16 genes of

interest between groups of patients from HCMC and other areas. There was also no

difference in the frequency of these genes found in strains isolated from male and

female patients. The four genes fyuA, iutA, PAI, and fimH account for the highest

percentage in all three types of clinical samples, so they can be used as markers for

ExPEC strains in general. The difference in frequency of papC, ibeA, kps MTII genes

among strains isolated from 3 types of specimens is statistically significant. ESBL￾producing strains of E. coli isolated from blood usually carry 6-7 genes encoding

virulence factors while strains from pus and urine samples usually carry 4-7 genes.

Up to 42 different combinations of genes encoding virulence factors were detected in

the strains. The strain carried at most 12 genes was isolated from urine sample. Higher

virulence gene diversity was found among clinical isolates of ESBL- producing E.

coli showing that clinical strains need more virulence factors.

v

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan ...............................................................................................................i

Lời cảm ơn ................................................................................................................ ii

Tóm tắt ..................................................................................................................... iii

Abstract .....................................................................................................................iv

Mục lục....................................................................................................................... v

Danh mục hình và đồ thị......................................................................................... viii

Danh mục bảng ..........................................................................................................ix

Danh mục từ viết tắt....................................................................................................x

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ......................................................................................1

1.1. Cơ sở hình thành luận văn...................................................................1

1.2. Mục tiêu nghiên cứu............................................................................1

1.3. Câu hỏi nghiên cứu..............................................................................1

1.4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.......................................................2

1.5. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................2

1.6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.............................................................2

CHƯƠNG 2. CƠ SỞ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ............................................3

2.1. Vi khuẩn E. coli...................................................................................3

2.1.1. Lịch sử .......................................................................................................3

2.1.2. Đặc tính chung..........................................................................................3

2.1.3. Các dạng kháng nguyên của E. coli........................................................5

2.2. Các dạng E. coli thường gặp ...............................................................6

2.2.1. E. coli hội sinh...........................................................................................6

2.2.2. E. coli gây bệnh.........................................................................................7

2.3. E. coli sinh β-lactamase phổ mở rộng (ESBL)..................................10

vi

2.3.1. Kháng với β-lactam................................................................................10

2.3.2. β-lactamase phổ mở rộng ......................................................................10

2.3.3. Phương pháp phát hiện E. coli sinh β-lactamase phổ mở rộng .........12

2.4. Các yếu tố độc lực trong E. coli ........................................................13

2.4.1. Yếu tố bám dính và xâm lấn..................................................................14

2.4.2. Yếu tố thu nhận sắt ................................................................................15

2.4.3. Yếu tố vượt qua hệ miễn dịch của vật chủ...........................................16

2.4.4. Độc tố.......................................................................................................16

2.5. Tình hình nghiên cứu E. coli sinh ESBL...........................................17

2.5.1. Tỷ lệ E. coli sinh ESBL trên thế giới ....................................................17

2.5.2. Tỷ lệ E. coli sinh ESBL tại Việt Nam ...................................................18

2.5.3. Nghiên cứu gen mã hóa yếu tố độc của E. coli sinh ESBL trên thế giới

..................................................................................................................19

2.5.4. Nghiên cứu gen mã hóa yếu tố độc của E. coli sinh ESBL tại Việt Nam

..................................................................................................................19

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP...................................................21

3.1. Vật liệu ..............................................................................................21

3.1.1. Dụng cụ và thiết bị .................................................................................21

3.1.2. Hóa chất ..................................................................................................22

3.1.3. Vật liệu sinh học .....................................................................................23

3.2. Phương pháp......................................................................................26

3.2.1. Phương pháp thu thập chủng E. coli có nguồn gốc từ bệnh phẩm....26

3.2.2. Phương pháp kiểm tra E. coli ...............................................................26

3.2.3. Phương pháp đĩa kháng sinh khuếch tán trên môi trường thạch .....26

3.2.4. Phương pháp xác định kiểu gen mã hóa yếu tố độc lực .....................28

3.3. Phân tích số liệu ................................................................................31

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ...........................................................32

4.1. Định danh sinh hóa các chủng E. coli thu nhận từ mẫu bệnh phẩm .32

vii

4.2. Xác định các chủng E. coli mang kiểu hình ESBL bằng phương pháp

khuếch tán trên đĩa thạch..............................................................................35

4.3. Phát hiện 16 gen mã hóa yếu tố độc lực của E. coli sinh ESBL bằng

PCR ...........................................................................................................37

4.3.1. Phát hiện sự hiện diện 16 gen mã hóa yếu tố độc của E. coli bằng PCR

..................................................................................................................37

4.3.2. Phân tích tỷ lệ 16 gen mã hóa các yếu tố độc lực của các chủng E. coli

sinh ESBL phân lập từ các mẫu bệnh phẩm .................................................44

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................64

5.1. Kết luận .............................................................................................64

5.2. Đề nghị ..............................................................................................64

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................65

PHỤ LỤC 1..............................................................................................................76

PHỤ LỤC 2..............................................................................................................89

PHỤ LỤC 3..............................................................................................................94