Tài liệu XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHANH VI KHUẨN DỊCH HẠCH (YERSINIA PESTIS) TỪ MẪU ĐẤT VÀ

TCNCYH 38 (5) - 2005

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHANH VI KHUẨN

DỊCH HẠCH (YERSINIA PESTIS) TỪ MẪU ĐẤT VÀ

NƯỚC NHIỄM KHUẨN

Lê Thanh Hoà1

, Nguyễn Thị Bích Nga1

,

Nguyễn Thị Ngọc Dao1

, Đỗ Ngọc Khuê 2

1 Viện Công nghệ Sinh học

(Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

2 Phân Viện Công nghệ mới và Bảo vệ Môi trường

(Trung tâm KHKT - CNQS), Bộ Quốc Phòng

ị

)

.

:

.

ị

ị

Bệnh dịch hạch là một loại bệnh truyền nhiễm cấp tính. Vi khuẩn d ch hạch có thể chọn làm tác nhân

khủng bố sinh học. Chẩn đoán nhanh vi khuẩn này từ đất nước là cần thiết. Vi khuẩn dịch hạch chứa 3 loại

Plasmid đặc hiệu tạo nên các yếu tố độc lực gây bệnh. Mục tiêu: (1) Xác định độ nhạy và chính xác của

phản ứng PCR chẩn đoán vi khuẩn dịch hạch. (2) Thực hiện phản ứng PCR với nguồn khuôn là ADN tổng

số, ADN của plasmid pPCP1 và vi khuẩn nguyên vẹn với độ pha loãng khác nhau (3 Giả nghiệm vi khuẩn

trong mẫu đất - nước và thực hiện chẩn đoán nhanh bằng PCR. Đối tượng và phương pháp: Vi khuẩn

dịch hạch đã vô hoạt. ADN tổng số bao gồm ADN của vi khuẩn dịch hạch được tách bằng DNeasy Kit, dùng

cặp mồi PLAF - PLAR (bám trên gen pla) để nhân đoạn gen pla có độ dài 480bp. Sau khi xác định độ nhạy

của phản ứng PCR, để thực hiện mục tiêu xây dựng Kit chẩn đoán nhanh Y Pestis, vi khuẩn được hoà

trong mẫu đất và nước theo phương pháp giả nghiệm để kiểm nghiệm phản ứng PCR nhằm xây dựng kit

phát hiện phân tử. Kết quả Với ADN tổng số pha loãng, phản ứng PCR thực hiện thành công ở hàm lượng

0,6ng, tương đương với 1 vi khuẩn Y. Pestis. Với vi khuẩn nguyên vẹn (không cần tách ADN tổng số), với

lượng vi khuẩn pha loãng ở nồng độ từ 101 đến 102 (khoảng 100 - 10 vi khuẩn) vẫn cho PCR đặc hiệu. Với

phương pháp giả nghiệm hoà vi khuẩn vào trong mẫu đất, nước, PCR đặc hiệu vẫn thực hiện thành công ở

độ pha loãng khoảng 1 ng ADN và 4 vi khuẩn làm khuôn Kết luận: Như vậy, bước đầu Kit chẩn đoán

phân tử vi khuẩn d ch hạch đã thử nghiệm thành công từ các loại mẫu, kể cả từ đất, nước sử dụng chỉ thị

gen pla của Plasmid pPCP1.

Từ khoá: dịch hạch, Yersinia pestis, plasmid pPCP1, gen pla, PCR, giả nghiệm.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi khuẩn dịch hạch (Yersinia Pestis) gây bệnh

nguy hiểm cho người và động vật, phân bố khắp

thế giới kể cả Việt Nam. Vùng Tây Nguyên và

Duyên Hải miền Trung Việt Nam, cho đến nay, vẫn

có nhiều trường hợp bị dịch hạch, do vậy, loại vi

khuẩn nguy hiểm này vẫn là mối đe doạ sức khoẻ

cộng đồng [3,4]. Dịch hạch do bọ chét và loài gặm

nhấm làm môi giới truyền lây gây bệnh, và tồn tại

lưu cữu trong đất và nước, tạo nên nguồn lây sang

người. Có 3 loại plasmid mà vi khuẩn này sở hữu

bao gồm, plasmid CD1 (chung với Y.

pseudotuberculosis và Y. enterocolitica); plasmid

MT1 và pPCP1 (là 2 loại riêng của Y. Pestis) [1].

Chẩn đoán nhanh vi khuẩn dịch hạch không có gì

khác là dựa vào phản ứng PCR, sử dụng các gen

độc lực của các loại plasmid này làm chỉ thị di

truyền phân tử, trong đó gen pla của pPCP1 được

coi là tin tưởng nhất [2,7]. Y. pestis phân lập ở

Việt Nam đã được chính thức giám định, sử dụng

gen pla, giải trình và phân tích trình tự của gen

này và đăng ký Ngân hàng Gen số AY305870 [2].

Plasmid độc lực pPCP1 của vi khuẩn dịch hạch Việt

Nam có mức độ bảo tồn tuyệt đối về thành phần

nucleotit của hệ gen, ít nhất là qua so sánh 480

nucleotit của phân đoạn gen pla, với các chủng

KIM5; CO92 [8,9] và một số chủng của Ấn Độ, thể

hiện tính gây bệnh thống nhất toàn cầu của loài vi

khuẩn này [2]. Mục tiêu:

1. Xác định độ nhạy và chính xác của

phản ứng PCR chẩn đoán vi khuẩn d ch hạch.

2. Thực hiện phản ứng PCR với nguồn

khuôn là ADN tổng số, ADN của plasmid

pPCP1 và vi khuẩn nguyên vẹn với độ pha

loãng khác nhau.

1