Tài liệu PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR ppt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG

PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Khóa: 2003 – 2007

Sinh viên thực hiện: TRỊNH THỊ THANH HUYỀN

Thành phố Hồ Chí Minh

09/2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG

PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR

Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:

PGS. TS. NGUYỄN NGỌC TUÂN TRỊNH THỊ THANH HUYỀN

KS. LƢƠNG QUÝ PHƢƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh

09/2007

iii

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:

Thầy PGS.TS. Nguyễn Ngọc Tuân, Giảng viên khoa Chăn nuôi thú y,

trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.

Cô PGS.TS Trần Thị Dân, Giảng viên khoa Chăn nuôi thú y, trƣờng Đại

Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.

KS. Lƣơng Quý Phƣơng, Trung tâm Phân tích thí nghiệm hóa sinh trƣờng

Đại Học Nông Lâm

Đã tận tình hƣớng dẫn, ủng hộ và giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa

luận tốt nghiệp.

Xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ

Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những

kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trƣờng.

- Ban giám đốc, thầy cô và các cán bộ công chức Trung tâm phân tích thí

nghiệm hóa sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực

tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp .

- Thầy Đinh Xuân Phát đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình

học tập cũng nhƣ thực hiện khóa luận.

Tập thể các bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học 29 - Trƣờng Đại học

Nông Lâm TP. HCM đã luôn bên tôi những lúc khó khăn, cùng tôi chia sẻ vui buồn

trong quá trình học và quá trình thực hiện khóa luận.

Và đặc biệt con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dƣỡng dục

con nên ngƣời, để con đƣợc nhƣ ngày hôm nay.

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2007.

Sinh viên: Trịnh Thị Thanh Huyền.

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

TRỊNH THỊ THANH HUYỀN, thực hiện khóa luận “Phân biệt ba loại

thịt heo, bò cừu bằng phƣơng pháp multiplex PCR”.

Hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân

KS. Lƣơng Quý Phƣơng

Thời gian thực hiện từ tháng 2/2007 đến tháng 8/2007, tại Trung tâm Phân

tích Thí nghiệm Hóa – Sinh, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.

Để tạo tiền đề trong việc giải quyết vấn đề gian lận thƣơng mại đối với sản

phẩm thịt tƣơi và thịt chế biến, bƣớc đầu chúng tôi tiến hành thiết lập quy trình

phân biệt ba loại thịt heo, bò, cừu bằng phƣơng pháp multiplex PCR.

Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau:

1) Tách chiết DNA từ thịt tƣơi và thịt đã xử lý nhiệt ở nhiệt độ: 800C/15’,

1200C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’ với tỷ số OD trung bình là 2,0 (thịt tƣơi), 1,9 (thịt

xử lý nhiệt)- tinh sạch, đạt tiêu chuẩn.

2) Sau khi tiến hành tối ƣu hóa phản ứng multiplex PCR bằng việc thử nghiệm

nhiều quy trình (gồm quy trình của Matsunaga và ctv (1998) và các thử nghiệm điều

chỉnh về thành phần hóa chất, nhiệt độ và thời gian của chu trình nhiệt, nồng độ mồi

trong phản ứng), chúng tôi đã xác định đƣợc quy trình thích hợp, trong đó nồng độ

MgCl2 2mM, lƣợng FSIM: RP: RB: RS lần lƣợt là 0,4: 0,83: 0,24: 0,17 M, nhiệt

độ và thời gian của chu kỳ nhiệt ở giai đoạn lặp lại là: biến tính (940C/1phút), bắt

cặp (540C/45giây), kéo dài (720C/1phút).

3) Sử dụng quy trình nultiplex PCR vừa tìm đƣợc đối với các hỗn hợp DNA của

cả ba loài trong đó nồng độ DNA bò, cừu giảm dần và đã xác định đƣợc nồng độ

của thịt cừu, bò mà quy trình này còn phát hiện đƣợc là 1ng/ l.

4) Chúng tôi tiếp tục thực hiện quy trình trên đối với các hỗn hợp thịt đã xử lý

nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau và rút ra kết luận là ở các nhiêt độ biến tính

800C/15’, 1200C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’ vẫn còn phân biệt đƣợc ba loài trên.

5) Thực hiện quy trình trên với bột thịt của 3 hãng CE, A, VY, kết quả bột thịt của

các hãng này có nguồn gốc lần lƣợt là: heo, bò, bò.

SUMMARY

TRINH THI THANH HUYEN in subject “Identifying meat of three meat species:

pig, bovine, sheep by multiplex PCR”

Suspervisors : PhD. Nguyen Ngọc Tuan

BCs. Luong Quy Phuong

To primarily resolve economic faudulent at meat products, we establish

protocol to identify meat of three species (pig, bovine, sheep) by multiplex PCR.

The results:

1) Extraction DNA from raw meats and heated meats (at temperatures:

800C/15 min, 1200C/15 min, 1200C/30 min, 1300C/15 min), average ratio of OD

were 2,0 (raw meat) and 1,9 ( heated meat) were pure, standard quality.

2) After optimizing procedures including protocol of Matsunaga et al.(1998)

and changing volume of reaction, element of chemical, temperature and time of

thermal cycle, concentration of primer), we established the suitable multiplex PCR

protocol. This protocol was MgCl2 2 mM; concentration of primers FSIM: RP: RB:

RS were 0,4: 0,83: 0,24: 0,17 M, temperature and thermal cycle (denature 940C/1

min, anealing 540C/45 sec, elongation 720C/1 min).

3) Aplying the multiplex PCR protocol to analyse mix DNA from three meat

with descending concentration on bovine DNA and sheep DNA, the limits of DNA

sample detected were 1ng/ l for bovine and sheep.

4) Using the protocol for mix heated meats to reach the conlusion that at

processing temperatures: 800C/15 min, 1200C/15min, 1200C/30 min, 1300C/15min

the meats of pig, bovine, sheep were still identified.

Meat and bone meal from three companies (CE, A, VY) were examined by the

established protocol, the products of those company were meat from pig, bovine

and bovine, respectively.

MỤC LỤC

NỘI DUNG TRANG

Bìa ............................................................................................................................. i

Trang tựa .................................................................................................................. ii

Lời cảm tạ................................................................................................................ iii

Tóm tắt khóa luận.................................................................................................... iv

Summary ..................................................................................................................v

Mục lục.................................................................................................................... vi

Danh sách các chữ viết tắt.........................................................................................x

Danh sách các bảng................................................................................................. xi

Danh sách các hình và biểu đồ.......................................................................................... xii

Chƣơng 1

MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1

1.1 Đặt vấn đề..........................................................................................................1

1.2 Mục đích............................................................................................................2

1.3 Yêu cầu..............................................................................................................2

Chƣơng 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................................3

2.1 Sơ lƣợc về thịt chế biến.....................................................................................3

2.1.1 Giới thiệu về thịt .........................................................................................3

2.1.2 Giới thiệu về thịt chế biến...........................................................................4

2.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thịt chế biến................................................4

2.1.3.1 Tình hình gian lận trên thị trƣờng thịt tƣơi và thịt chế biến của

thế giới..........................................................................................................4

2.1.3.2 Tình hình xuất nhập khẩu động vật và sản phẩm chế biến từ

động vật ở Việt Nam ....................................................................................5

2.2 Một vài đặc điểm về tế bào động vật.................................................................6

2.3 Cơ sở để phân biệt các loại thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR...7

2.4 Các phƣơng pháp phân biệt các loại thịt ...........................................................8

2.4.1 Phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi quang học...................................8

2.4.2 Miễn dịch liên kết enzym (ELISA) ............................................................8

2.4.3 Protein array................................................................................................9

2.4.4 Điện di 2 chiều............................................................................................9

2.4.5. Giới thiệu chung về phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction).....10

2.4.6 Nguyên tắc multiplex PCR.......................................................................16

2.5 Các công trình nghiên cứu về phát hiện loài trong thịt chế biến bằng

phƣơng pháp multiplex PCR.................................................................................16

Chƣơng 3

NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................18

3.1 Nội dung thực hiện ..........................................................................................18

3.2 Thời gian và địa điểm tiến hành ......................................................................18

3.3 Vật liệu ............................................................................................................19

3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA .....................................................................19

3.3.2 Đoạn mồi...................................................................................................19

3.3.3 Hóa chất ....................................................................................................19

3.3.3.1 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA.............................................19

3.3.3.2 Hóa chất dùng trong điện di ...........................................................19

3.3.3.3 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR...............................................20

3.3.3.4 Thiết bị và dụng cụ.........................................................................20

3.4 Phƣơng pháp tiến hành ....................................................................................20

3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu................................................................................20

3.4.2 Phối hợp các loại thịt để tạo hỗn hợp thịt và xử lý nhiệt..........................20

3.4.3 Tách chiết DNA........................................................................................21