Tài liệu Công nghệ sinh học_ Chương 4 doc

Chương 4

Công nghệ chuyển gen ở động vật

I. Khái niệm chung

1. Ðộng vật chuyển gen

Ðộng vật chuyển gen là động vật có gen ngoại lai (gen

chuyển) xen vào trong DNA genome của nó. Gen ngoại lai này phải

được truyền lại cho tất cả mọi tế bào, kể cả các tế bào mầm. Việc

chuyển gen ngoại lai vào động vật chỉ thành công khi các gen này di

truyền lại cho thế hệ sau.

2. Sự phát triển của khoa học chuyển gen ở động vật

Vào thập kỷ 1970, các thí nghiệm nghiên cứu đã được thực

hiện với các tế bào ung thư biểu bì phôi và các tế bào ung thư quái

thai để tạo nên chuột thể khảm (Brinster,1974; Mintz và Illmensee,

1975; Bradley, 1984). Trong các động vật thể khảm này, các tế bào

nuôi cấy lấy từ một dòng chuột được đưa vào phôi của một dòng

chuột khác bằng quần tụ phôi trực tiếp (direct embryo aggregation)

hoặc bằng cách tiêm vào phôi ở giai đoạn phôi nang (blastocyst).

Chuột thể khảm trưởng thành có thể được sinh ra bằng sự đóng góp

tế bào từ các bố mẹ khác nhau và sẽ biểu hiện tính trạng của mỗi

dòng. Một kiểu chuyển genome khác ở động vật là chuyển nhân

nguyên từ một phôi vào tế bào trứng chưa thụ tinh của một dòng

nhận khác một cách trực tiếp (Mc Grath và Solter,1983). Những

động vật biến đổi gen bằng chuyển nhân này được tạo ra mà không

cần một kỹ thuật tái tổ hợp DNA nào và chúng là sự kiện quan trọng

trong việc làm sáng tỏ các cơ chế điều hoà di truyền ở động vật có

vú.

Bước phát triển tiếp theo của kỹ thuật chuyển gen được thực

hiện bằng cách tiêm retrovirus vào các phôi chuột đã được nuôi cấy

trước (Jeanish và Mintz, 1974; Jeanish, 1976). Thông tin di truyền

của virus được chuyển một cách hiệu quả vào genome của động vật

nhận và sau đó ít lâu kỹ thuật sử dụng retrovirus làm vector cho các

111

đoạn DNA ngoại lai đặc biệt đã được phát triển (Stuhmann, 1984).

Sử dụng retrovirus như là vật truyền trung gian đối với việc chuyển

gen đã tạo nên hiện tượng khảm ở mức độ cao. Tuy nhiên kích thước

của gen chuyển bị giơí hạn và các trình tự của virus có thể làm nhiễu

sự biểu hiện của gen chuyển. Sự đính các bản sao đơn của gen

chuyển nằm bên cạnh DNA của virus có thể là có lợi nếu có yêu cầu

tách dòng các locus đính vào.

Trong những năm gần đây, một số kỹ thuật tạo động vật

chuyển gen khác đã được công bố: phương pháp chuyển gen bằng

cách sử dụng tế bào gốc phôi (Grossler,1986), phương pháp chuyển

các đoạn nhiễm sắc thể nguyên (ví dụ như chuột “transomic“, Richa

và Lo, 1988), chuyển gen trực tiếp vào tinh trùng kết hợp với thụ

tinh in vitro (Lavitrano, 1989). Tuy nhiên, phương pháp vi tiêm

DNA vào tiền nhân của hợp tử là phương pháp có hiệu quả nhất,

được sử dụng rộng rãi nhất để tạo động vật chuyển gen. Sử dụng

phương pháp này, các gen chuyển có chiều dài trên 50 kb của virus,

sinh vật tiền nhân, thực vật, động vật không xương sống hoặc động

vật có xương sống có thể được chuyển vào genome của động vật có

vú và chúng có thể được biểu hiện ở cả tế bào sinh dưỡng và tế bào

sinh sản.

II. Công nghệ tạo động vật chuyển gen

Trên cơ sở công nghệ DNA tái tổ hợp, ngành chăn nuôi đang

đứng trước những cơ hội thay đổi có tính cách mạng. Ngày nay

người ta có thể tạo ra những động vật mang các đặc tính kỳ diệu mà

bằng phương pháp lai tạo bình thường không thể thực hiện được.

Công nghệ tạo động vật chuyển gen là một quá trình phức tạp và ở

những loài khác nhau có thể khác nhau ít nhiều nhưng nội dung cơ

bản gồm các bước chính sau: tách chiết, phân lập gen mong muốn và

tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật; tạo cơ sở vật liệu

biến nạp gen; biến nạp gen vào phôi động vật; nuôi cấy phôi và cấy

truyền hợp tử (đối với động vật bậc cao); phân tích đánh giá tính ổn

định và sự biểu hiện của gen lạ và tạo ra dòng động vật chuyển gen

gốc một cách liên tục, sản xuất động vật chuyển gen.

112

Hình 4.1: Sơ đồ tạo động vật chuyển gen

1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện

trong tế bào động vật

1.1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn

Một gen ngoại lai trước khi được chuyển vào genome của tế

bào vật chủ để tạo ra động vật chuyển gen phải được phân lập và

tinh chế hay nói cách khác là nó phải được tạo dòng. Các công cụ sử

dụng để tạo dòng bao gồm các enzyme đặc biệt có hoạt tính cắt và

nối DNA (enzyme hạn chế và ligase), các mẫu dò (probe), vector và

tế bào vật chủ. Tế bào vật chủ thường được sử dụng là tế bào vi

khuẩn E.coli và vector thường được sử dụng là plasmid.

Việc tách chiết một gen riêng lẻ là rất phức tạp bởi vì DNA

mẫu chứa hàng triệu gen. Do đó để thực hiện điều này, DNA mẫu

chứa gen mong muốn và vector plasmid phải được cắt bởi cùng một

loại enzyme hạn chế. Các đoạn DNA mẫu sau khi được cắt có mang

gen mong muốn sẽ được xen vào vector plasmid và các đầu của các

đoạn DNA mẫu này và các đầu của vector plasmid sẽ được nối với

nhau nhờ ligase tạo thành plasmid tái tổ hợp. Sau đó các plasmid tái

tổ hợp được biến nạp vào các tế bào vi khuẩn E.coli và các tế bào vi

113

khuẩn tiến hành sinh trưởng. Vào thời điểm này, các tế bào vi khuẩn

chứa plasmid mang gen mong muốn sẽ được phát hiện bằng mẫu dò.

Chúng được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để sinh trưởng

phát triển tạo ra hàng triệu bản sao của vector chứa gen này. Vector

chứa gen này sẽ được tách ra khỏi tế bào vi khuẩn và gen mong

muốn sẽ được tách chiết. Phương pháp này có thể tạo ra hàng triệu

bản sao của gen mong muốn mà không bị nhiễm bởi các gen khác.

Gen chuyển có nguồn gốc từ genome này chứa các đoạn exon mã

hoá và các đoạn intron không mã hoá (Hình 4.2).

Người ta cũng có thể phân lập được gen mong muốn từ sản

phẩm biểu hiện của nó như mRNA hoặc protein. Từ mRNA dưới tác

động của enzyme sao chép ngược sẽ tổng hợp ra DNA bổ sung mạch

đơn (single strand complement DNA-ss cDNA), tiếp theo là DNA

bổ sung mạch kép (double strand complement DNA- ds cDNA).

DNA bổ sung (complement DNA- cDNA) này khác với DNA gốc là

không chứa các intron mà chỉ bao gồm các exon (Hình 4.2). Hoặc từ

sản phẩm protein, có thể suy ra trình tự nucleotid của gen cấu trúc

trên cơ sở trình tự các axit amin trong phân tử protein. Sau đó có thể

thiết kế cặp mồi (primer) để dò tìm đoạn gen mong muốn.

Hình 4.2: So sánh hai dạng gen chuyển

Dạng genome bao gồm tất cả các đoạn exon và intron xuất hiện

một cách tự nhiên. Các đoạn intron liên quan đến việc cắt ghép

mRNA và biểu hiện của gen. Dạng cDNA là một trình tự chỉ bao

gồm các đoạn exon mã hoá protein của gen.

1. 2. Tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật

Ðể tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật, các

vùng chức năng khác nhau của gen có nguồn gốc từ các loài khác

114

nhau có thể được kết hợp lại với nhau trong ống nghiệm bằng cách

sử dụng enzyme hạn chế và ligase. Tất cả các thành phần của gen có

thể được tách chiết và tái tổ hợp để tạo thành một cấu trúc gen

chuyển biểu hiện (Hình 4.3).

Ở các đầu của cấu trúc đầy đủ này có thể được sửa đổi bằng

cách bổ sung các trình tự polylinker chứa một số vị trí nhận biết các

enzyme hạn chế khác nhau. Trình tự polylinker cho phép có thể xen

vào cấu trúc này một vector để kiểm tra và tạo dòng.

Hình 4.3: Sơ đồ cấu trúc gen chuyển biểu hiện

enhancer: gen tăng cường

ATG: vị trí khởi đầu phiên mã

SIG: trình tự tín hiệu

AAA: đuôi polyA

Gen chuyển được đi kèm với các trình tự không mã hoá có vai

trò điều hoà sự biểu hiện của gen. Các yếu tố điều hoà cũng có thể

nằm ở trong đoạn intron. Yếu tố điều hoà ở gần đầu 5’ của gen là

promoter, có vai trò quyết định trong việc điều hoà sự biểu hiện của

gen. Sự biểu hiện của gen có thể xảy ra trong tất cả các mô của cơ

thể (không đặc hiệu) hoặc chỉ ở các mô đặc biệt. Hay nói cách khác

gen cấu trúc muốn hoạt động để biểu hiện ra protein mà nó qui định

trong hệ thống tế bào nhất định thì phải có promoter thích hợp với hệ

thống mà nó hoạt động. Promoter ở tế bào động vật có nguồn gốc

hoặc từ động vật như methallothionein (MT), thymidine kinase, ß￾actin, amylase, insulin, ß-lactoglobulin, adiposite P2 ... hoặc từ virus

động vật như Simian virus (SV40), Rous sarcoma virus (RSV)...

Một yếu tố điều hoà khác là yếu tố tăng cường (enhancer), có

chức năng tăng cường sự biểu hiện của gen, không phụ thuộc vào vị

trí và sự định hướng đối với gen. Các yếu tố tăng cường xuất hiện có

tương quan với các trình tự quá mẫn cảm với Dnase và ở cách gen

một đoạn khoảng vài kilobase. Ðầu 3’ của gen cũng phải mang một

trình tự poly-A để đảm bảo thích hợp cho quá trình phiên mã và dịch

mã.

115

2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen

Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là

trứng ở giai đoạn tiền nhân (pronucleus), giai đoạn mà nhân của tinh

trùng và trứng chưa dung hợp (fusion) với nhau. Ở giai đoạn này tổ

hợp gen lạ có cơ hội xâm nhập vào genome của động vật nhờ sự tái

tổ hợp DNA của tinh trùng và của trứng. Do tế bào phôi chưa phân

chia và phân hoá nên tổ hợp gen lạ được biến nạp vào giai đoạn này

sẽ có mặt ở tất cả các tế bào kể cả tế bào sinh sản của động vật

trưởng thành sau này.

Ðối với động vật có vú, trứng chín được thu nhận bằng phương

pháp sử dụng kích dục tố theo chương trình đã được xây dựng cho

mỗi loài hoặc bằng phương pháp nuôi cấy trứng trong ống nghiệm.

Sau đó thụ tinh nhân tạo để tạo ra trứng tiền nhân.

Các phương pháp sử dụng hiện nay để chuyển gen vào tế bào

chủ nói chung là hiệu quả không cao. Ðể tạo ra một động vật chuyển

gen, yêu cầu cần phải sử dụng hàng trăm thậm chí hàng ngàn trứng

thụ tinh. Ở bò để đạt được một lượng phôi lớn như thế, nó phải được

kích thích để rụng một lượng lớn trứng (siêu rụng trứng) thành thục

và được thụ tinh nhân tạo. Sự hiểu biết về sự kiểm soát chức năng

buồng trứng tăng lên đang cải tiến hiệu quả để có đủ số lượng trứng

thụ tinh. Việc kích thích gây siêu rụng trứng đòi hỏi sự hiểu biết một

cách chi tiết các yếu tố hormone kiểm soát sự phát triển của trứng ở

trong buồng trứng. Quá trình phát triển của trứng đã được nghiên

cứu mạnh mẽ và đã đạt được một số kết quả trong những năm qua.

Các nghiên cứu đã tập trung khảo sát các cơ chế cơ bản kiểm soát sự

sinh trưởng và thành thục của trứng và chức năng của thể vàng.

Chúng mở đường cho sự phát triển các phương pháp điều hoà chu

trình động dục để gây siêu rụng trứng một cách tỉ mỉ và chính xác

hơn.

Có lẽ sự phát triển quan trọng nhất trong sinh lý học buồng

trứng trong những năm mới đây là sự khám phá ra hormone inhibin.

Inhibin là hormone ức chế sự rụng trứng, nó làm giảm tỉ lệ rụng

trứng. Một vài giống động vật có tốc độ rụng trứng cao hiếm thấy

như dòng Booroola của cừu Merino ở Úc có mức inhibin trong máu

thấp. Trâu bò miễn dịch với inhibin có mức inhibin trong máu thấp

116