Tách Dòng Gen Mã Hóa Cho Eyme Cinanamyl Alcolhol Dehydrogenase Tham Gia Vào Quá Trình Sinh Tổng Hợp Lignin Từ Cây Bạch Đàn Urô Trồng Tại Việt Nam

Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học

1

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hữu Cường –

Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện công nghệ sinh học và Ths. Bùi Văn

Thắng – Trung tâm Giống và Công nghệ sinh học – Khoa Lâm học – Trường

Đại học Lâm nghiệp đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong quá

trình thực hiện khóa luận này.

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới GS. TS. Lê Trần Bình, TS. Chu

Hoàng Hà, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và đóng góp những ý

kiến quý báu cho tôi trong thời gian thực tập tại Phòng Công nghệ tế bào thực

vật, Viện Công nghệ sinh học.

Tôi xin chân thành cảm ơn CN. Hoàng Hà và tập thể cán bộ Phòng

Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ tôi

hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gửi tới toàn thể các thầy cô giáo trong Bộ

môn Giống và Công nghệ sinh học, gia đình, bạn bè, những người đã giúp đỡ,

động viện và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập.

Hà Nội, tháng 5 năm 2009

Sinh Viên

Đồng Thị Liên

Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học

2

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................ 7

1.1. Giới thiệu chung về cây bạch đàn urophylla...................................... 7

1.1.1. Nguồn gốc........................................................................................ 7

1.1.2. Phấn bố............................................................................................ 7

1.1.3. Giá trị sử dụng................................................................................ 8

1.2. Lignin và chu trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật ......................... 8

1.3. Giới thiệu về enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase.................. 10

1.4. Cấu trúc và chức năng của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl

alcohol dehydrogenase (CAD). ................................................................. 11

1.4.1. Cấu trúc......................................................................................... 11

1.4.2. Chức năng ..................................................................................... 12

1.5. Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nghiên cứu...... 13

1.5.1. Kỹ thuật PCR ............................................................................... 13

1.5.2. Kỹ thuật reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT￾PCR) ........................................................................................................ 15

1.5.3. Kỹ thuật biến nạp plasmid vào E. coli ....................................... 16

1.5.4. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (Colony-PCR)............... 17

1.5.5. Kỹ thuật tách dòng....................................................................... 17

1.5.6. Kỹ thuật xác định trình tự nucleotit........................................... 19

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP............................................. 20

2.1. Vật liệu nghiên cứu............................................................................. 20

2.1.1. Vật liệu sinh học ........................................................................... 20

2.1.2. Hóa chất và thiết bị ...................................................................... 20

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................... 16

2.2.1. Phƣơng pháp thiết kế mồi ........................................................... 21

Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học

3

2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số ....................................... 21

2.2.3. Phƣơng pháp khử DNA ............................................................... 22

2.2.4. Phƣơng pháp RT-PCR................................................................. 23

2.2.5. Phƣơng pháp tạo plasmid tái tổ hợp mang gen CAD............... 24

2.2.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli ............................. 25

2.2.7. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc ................................. 26

2.2.8. Tách chiết plasmid ....................................................................... 26

2.2.9. Phƣơng pháp cắt plasmid............................................................ 27

2.2.10. Phƣơng pháp xử lý trình tự gen thu đƣợc ............................... 28

3.1. Kết quả thiết kế mồi ........................................................................... 29

3.2. Kết quả tách ARN tổng số ................................................................. 29

3.3. Kết quả tối ƣu hóa phản ứng PCR.................................................... 32

3.4. Kết quả thôi gel ................................................................................... 33

3.5. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli

DH5α ........................................................................................................... 33

3.6. Kết quả colony-PCR........................................................................... 36

3.7. Kết quả tách chiết plasmid ................................................................ 37

3.8. Kết quả cắt plasmid bằng enzyme BamHI...................................... 38

3.9. Kết quả đọc trình tự gen CAD. ......................................................... 39

3.10. Kết quả so sánh trình tự gen CADs................................................ 41

3.10.1. So sánh độ tƣơng đồng .............................................................. 41

3.10.2. Lập cây phát sinh chủng loại MP (Maximum Parsimony)... 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................... 44

KẾT LUẬN................................................................................................. 44

KIẾN NGHỊ ............................................................................................... 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................ 45

Khóa luận tốt nghiệp Đồng Thị Liên: 50 – Công nghệ sinh học

4

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleic Acid

bp base pair

cDNA Complementary DNA

CTAB Cetyl-Trimethyl-Ammonium Bromide

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid

g/l gam/lít

IPTG Isopropyl-thio-beta-D-galactoside

Kb Kilobase

KDa KiloDalton

LB Luria Bertani

mg/l miligam/lít

OD Optical Density

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Ribonucleic Acid

RNase Ribonuclease H

RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction

SDS Sodium dodecyl sulphate

TAE Tris - Acetic acide - EDTA

Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase

TE Tris – EDTA

v/ph vòng/phút

X-Gal 5-brom- 4-chloro-3-indolyl--D-galactosidase