Tách chiết, phân tích aflatoxin trong thực phẩm và dược liệu bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC – HÀ NỘI

---------oOo---------

NGUYỄN THỊ NGUYỆT THU

TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH AFLATOXIN

TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU

BẰNG CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC MIỄN DỊCH

KẾT HỢP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC – HÀ NỘI

----------------------

NGUYỄN THỊ NGUYỆT THU

TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH AFLATOXIN

TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU

BẰNG CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC MIỄN DỊCH

KẾT HỢP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc

Mã số: 62.73.15.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. Trịnh Văn Quỳ

2. PGS.TSKH. Nguyễn Lê Trang

HÀ NỘI - 2011

- i -

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết

quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công

trình nào khác.

Nguyễn Thị Nguyệt Thu

- ii -

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

PGS.TS. Trịnh Văn Quỳ, nguyên Viện Trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

và PGS.TSKH. Nguyễn Lê Trang, nguyên Trưởng phòng Hóa Miễn dịch Viện

Pasteur TP.HCM, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và cho tôi nhiều kiến thức quý báu để

tôi hoàn thành luận án.

Ban Giám đốc Viện Pasteur TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành

luận án đúng thời gian quy định.

PGS.TS. Trương Thị Xuân Liên, nguyên Viện phó Viện Pasteur TP.HCM đã đóng

góp ý kiến, chỉ dẫn và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án.

Các anh chị Viện Vệ sinh Y tế Công cộng, Khoa Y học cổ truyền trường Đại học Y

Dược, và Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm TP.HCM đã cung cấp các mẫu thực

phẩm, dược liệu và thuốc đông dược để tôi thực hiện đề tài.

Các thầy, và các anh chị Bộ môn Hóa phân tích Trường Đại học Dược Hà Nội đã

giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường.

Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng Hóa lý và phòng Hóa

Miễn Dịch - Viện Pasteur TP.HCM đã động viên, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn

với tôi trong công việc.

Nguyễn Thị Nguyệt Thu

- iii -

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan ...............................................................................................................i

Lời cảm ơn..................................................................................................................ii

Mục lục.......................................................................................................................iii

Danh mục các chữ viết tắt.......................................................................................viii

Danh mục hình ........................................................................................................... x

Danh mục bảng........................................................................................................ xiv

ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................. 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 4

1.1. TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN...................................................................... 4

1.1.1. Phát hiện aflatoxin...................................................................................... 4

1.1.2. Aspergillus flavus và aflatoxin..................................................................... 4

1.1.3. Tính chất hóa, lý của aflatoxin.................................................................... 5

1.1.4. Độc tính của aflatoxin.................................................................................. 8

1.1.5. Giới hạn của aflatoxin trong thực phẩm .................................................. 10

1.1.6. Giới hạn aflatoxin trong dược liệu............................................................ 12

1.2. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN........................................... 12

1.2.1. Lấy mẫu ..................................................................................................... 12

1.2.2. Chuẩn bị mẫu ............................................................................................ 12

1.2.3. Phân tích mẫu............................................................................................ 16

- iv -

1.3. NHỮNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC MIỄN DỊCH

CHO AFLATOXIN..................................................................................................23

1.3.1. Kháng thể................................................................................................... 23

1.3.2. Cộng hợp kháng nguyên aflatoxin – BSA ................................................ 24

1.3.3. Tạo kháng thể kháng aflatoxin ................................................................. 26

1.3.4. Tinh chế kháng thể .................................................................................... 30

1.3.5. Cố định kháng thể vào pha rắn................................................................. 31

1.3.6. Các đặc tính chiết xuất pha rắn của chất hấp thụ ái lực miễn dịch ........ 34

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................... 38

2.1. VẬT LIỆU........................................................................................................ 38

2.1.1. Thiết bị....................................................................................................... 38

2.1.2. Hóa chất..................................................................................................... 38

2.2. PHƯƠNG PHÁP.............................................................................................. 40

2.2.1. Phương pháp gây miễn dịch tạo kháng thể kháng aflatoxin ................... 40

2.2.2. Phương pháp khuếch tán kép trên thạch ................................................. 41

2.2.3. Phương pháp tinh chế kháng thể dùng muối amoni sulfat...................... 42

2.2.4. Phương pháp thẩm tích (đưa protein ở dạng tủa trở lại dạng dung dịch)42

2.2.5. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamid có natri dodecyl sulfat ..... 43

2.2.6. Xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford......................... 45

2.2.7. Cộng hợp protein vào gel sepharose CL-4B hoạt hóa với CNBr............. 45

- v -

2.2.8. Phương pháp nén cột................................................................................. 45

2.2.10. Pha dung dịch aflatoxin chuẩn ............................................................... 46

2.2.11. Phương pháp chiết aflatoxin từ mẫu cần phân tích bằng cột IAC........ 47

2.2.12. Phương pháp chiết aflatoxin từ mẫu cần phân tích bằng cột SPE C18 . 47

2.2.13. Phương pháp làm giả mẫu nhiễm aflatoxin ........................................... 48

2.2.14. Phương pháp tạo dẫn xuất các aflatoxin ................................................ 48

2.2.15. Phương pháp sắc ký lỏng pha đảo phân tích aflatoxin.......................... 48

2.2.16. Phương pháp khảo sát các thông số kỹ thuật của cột sắc ký ái lực bắt

aflatoxin............................................................................................................... 48

2.2.16.1. Độ lặp lại của các cột......................................................................... 48

2.2.16.2. Dung lượng cột .................................................................................. 49

2.2.16.3. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng ........................................... 49

2.2.16.4. Xác định độ tuyến tính....................................................................... 50

2.2.16.5. Xác định hiệu suất thu hồi................................................................. 50

2.2.16.6. Theo dõi độ ổn định của cột............................................................... 51

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ .......................................................................................... 52

3.1. CHẾ TẠO CỘT SẮC KÍ ÁI LỰC CHO AFLATOXIN ............................... 52

3.1.1. Sản xuất kháng thể kháng aflatoxin ......................................................... 52

3.1.1.1. Gây miễn dịch trên thỏ......................................................................... 53

3.1.2. Chế tạo cột sắc ký ái lực bắt aflatoxin ...................................................... 58

3.1.2. Chế tạo cột sắc ký ái lực bắt aflatoxin……………………………………..59

3.1.1.2. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch ………………………………………….. 54

2.2.9. Phương pháp sắc ký ái lực miễn dịch……………………………………..46

- vi -

3.1.2.1. Chọn nồng độ kháng thể liên kết với gel ái lực ................................... 59

3.1.2.2. Khảo sát các thông số kỹ thuật của cột IAC Pasteur........................... 63

3.2. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỘT IAC-PASTEUR CHO PHÂN

TÍCH AFLATOXIN TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU........................... 68

3.2.1. Khảo sát trên mẫu thực phẩm .................................................................. 68

3.2.1.1. Khảo sát trên mẫu ngô......................................................................... 68

3.2.1.2. Khảo sát trên mẫu lạc .......................................................................... 76

3.2.2. Khảo sát trên mẫu dược liệu..................................................................... 81

3.2.2.1. Khảo sát trên mẫu cam thảo ................................................................ 81

3.2.2.2. Khảo sát trên mẫu gừng....................................................................... 87

3.3. SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU KHÁC .............................. 92

3.3.1. So sánh với phương pháp xử lý mẫu bằng cột SPE C18 ........................... 92

3.3.1.1. Trên nền mẫu thực phẩm .................................................................... 92

3.3.1.2. Trên nền mẫu dược liệu....................................................................... 96

3.3.2. So sánh với phương pháp xử lý mẫu bằng cột sắc ký ái lực của hãng

Vicam................................................................................................................... 99

3.3.2.1. So sánh trên mẫu cộng chuẩn ............................................................. 99

3.3.2.2. So sánh trên mẫu thực ....................................................................... 103

3.4. ÁP DỤNG CỘT IAC-PASTEUR LÀM SẠCH MẪU ĐỊNH LƯỢNG

AFLATOXIN TRÊN MỘT SỐ NỀN MẪU THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU.... 105

3.4.1. Trên một số nền mẫu thực phẩm............................................................ 105

- vii -

3.4.2. Trên một số nền mẫu dược liệu .............................................................. 106

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN...................................................................................... 107

4.1. BÀN LUẬN VỀ CHẾ TẠO CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC CHO AFLATOXIN..107

4.1.1. Về sản xuất kháng thể kháng aflatoxin .................................................. 107

4.1.1.1. Về gây miễn dịch trên thỏ…………………………………………….107

4.1.1.2. Về kiểm tra đáp ứng miễn dịch .......................................................... 109

4.1.2. Về chế tạo cột sắc ký ái lực bắt aflatoxin................................................ 111

4.1.2.1. Về chọn nồng độ kháng thể liên kết vào gel ái lực ............................ 111

4.1.2.2. Về khảo sát các thông số kỹ thuật của cột IAC Pasteur …………..112

4.2. BÀN LUẬN VỀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỘT IAC-PASTEUR CHO

PHÂN TÍCH AFLATOXIN TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU............. 114

4.3. BÀN LUẬN VỀ SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU KHÁC 118

4.3.1. Với phương pháp xử lý mẫu bằng cột SPE C18 ...................................... 118

4.3.2. Với phương pháp xử lý mẫu bằng cột IAC của hãng Vicam................. 121

4.4. BÀN LUẬN VỀ ÁP DỤNG CỘT IAC-PASTEUR ĐỂ XÁC ĐỊNH

AFLATOXIN TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU ................... 122

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.................................................................................... 125

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ...................................................... 127

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

- viii -

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFB1 Aflatoxin B1

AFB2 Aflatoxin B2

AFG1 Aflatoxin G1

AFG2 Aflatoxin G2

AFM1 Aflatoxin M1

AOAC Association of Official Analytical Chemists

BSA Bovine serum albumin (Albumin huyết thanh bò)

CD Cyclodextrin

CNBr Cyanogen bromide

EU European Union (Liên minh châu Âu)

FDA US Food and Drug Administration (Cơ quan quản lý thuốc và

thực phẩm Hoa Kỳ)

Fab Antigen binding fragment (Mảnh gắn kháng nguyên)

Fc Crystalizable fragment

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

HPLC High-performance liquid chromatography

HCC Hepatocellular carcinoma

HBV Hepatitis B virus

HCV Hepatitis C virus

HBsAg Hepatitis B surface Antigen

IAC Immuno Affinity Chromatography (Sắc ký ái lực miễn dịch)

IARC International Agency for Research on Cancer (Cơ quan

nghiên cứu ung thư quốc tế)

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry (Liên

đoàn quốc tế về hoá học thuần túy và ứng dụng)

- ix -

LC-MS Liquid chromatography with mass spectrometry

mAb Monoclonal antibody

NP-HPLC Normal-phase high-performance liquid chromatography

ppb parts per billion

RP-HPLC Reversed phase high-performance liquid chromatography

SPE Solid Phase Extraction

TFA Trifluoro acetic acid

TLC Thin layer chromatography

- x -

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Bào tử trần và bộ máy mang bào tử trần của loài Aspergillus flavus.......... 4

Hình 1.2 Ngô và lạc nhiễm vi nấm Aspergillus flavus.............................................. 5

Hình 1.3 Bào thai thỏ (0,1mg AFB1/kg) có hốc mắt bị rộng so với nhóm chứng...... 8

Hình 1.4 Mối liên hệ giữa nguy cơ tiếp xúc với aflatoxin và ung thư tế bào gan...... 9

Hình 1.5 Cấu trúc điển hình của cột chiết xuất pha rắn ........................................ ..13

Hình 1.6 Làm sạch mẫu bằng cột mycosep đa chức năng ...................................... 14

Hình 1.7 Làm sạch mẫu bằng cột IAC................................................................... 15

Hình 1.8 Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng hai chiều. Thí nghiệm được thực hiện trên hai

hệ thống dung môi khác nhau, được trình bày trên hai hướng vuông góc

với nhau................................................................................................... 17

Hình 1.9 Quá trình tạo dẫn xuất biến AFB1 và AFG1 thành AFB2a và AFG2a ......... 19

Hình 1.10 Phản ứng tạo dẫn xuất của aflatoxin với Brom........................................ 21

Hình 1.11 So sánh sắc ký đồ của quá trình phân tích aflatoxin khi có và không có

tạo dẫn xuất với cyclodextrin: (A) không tạo dẫn xuất; (B) tạo dẫn xuất

với 10-2M -CD; (C) tạo dẫn xuất với 10-2M DM--CD .......................... 21

Hình 1.12 Điện di đồ của quá trình phân tích aflatoxin bằng kỹ thuật điện di mao

quản MEKC pha ngược ........................................................................... 22

Hình 1.13 Cấu tạo của phân tử kháng thể ................................................................. 23

Hình 1.14 Các dạng liên kết hóa học giữa hai phân tử kháng nguyên và kháng thể .. 23

Hình 1.15 Tạo kháng thể đa dòng............................................................................. 24

Hình 1.16 Phản ứng cộng hợp AFB1 với BSA.......................................................... 25

Hình 1.17 Các hướng sử dụng để cộng hợp aflatoxin vào protein............................. 26

Hình 1.18 Các giai đoạn tạo kháng thể đơn dòng ..................................................... 28

Hình 1.19 Cấu trúc kháng thể và các phân mảnh của nó.......................................... 29

Hình 1.20 Vị trí liên kết của kháng thể vào protein A, G, L và lectin ...................... 31

- xi -

Hình 1.21 Cố định kháng thể qua nhóm amin bậc 1 trên gel hoạt hóa có nhóm

carbonyldiimidazol (CDI)........................................................................ 33

Hình 1.22 Các tình huống có thể xảy ra khi kháng thể được gắn ngẫu nhiên vào

pha rắn..................................................................................................... 34

Hình 2.1 Nguyên tắc thẩm tích............................................................................... 42

Hình 2.2 Nguyên tắc điện di................................................................................... 44

Hình 3.1 Sơ đồ các bước tạo kháng thể kháng aflatoxin ......................................... 52

Hình 3.2 Gây miễn dịch trên thỏ với cộng hợp AFB1-BSA và các giai đoạn lấy

máu ......................................................................................................... 53

Hình 3.3 Phản ứng khuếch tán kép trên thạch giữa BSA và huyết thanh thỏ........... 54

Hình 3.4 Kiểm tra kháng thể sau tinh chế............................................................... 55

Hình 3.5 Loại kháng thể kháng BSA...................................................................... 56

Hình 3.6 Phản ứng khuếch tán kép trên thạch......................................................... 56

Hình 3.7 (a) AFB1 chuẩn, tR=4,32 phút (b) AFB1 sau khi qua cột IAC, tR=4,31

phút ......................................................................................................... 57

Hình 3.8 (A ) Mô hình kháng thể liên kết vào hạt gel Sepharose, (B) Nguyên tắc

cộng hợp protein vào gel Sepharose được hoạt hóa với –CNBr................ 59

Hình 3.9 Cột sắc ký ái lực bắt aflatoxin tự chế tạo.................................................. 63

Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin từ

0,625 ng đến 10 ng cho qua cột và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ.. 65

Hình 3.11 Theo dõi độ ổn định của cột IAC trong 2 năm ......................................... 66

Hình 3.12 (a) Sắc ký đồ của mẫu ngô không nhiễm aflatoxin, (b) Sắc ký đồ của

mẫu ngô không nhiễm aflatoxin được thêm chuẩn aflatoxin .................... 68

Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho

qua cột từ 0,625 ng đến 10 ng và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ

trên nền mẫu ngô ..................................................................................... 69

Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho

qua cột và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ trên nền mẫu ngô ........... 72

- xii -

Hình 3.15 (a) Sắc ký đồ của mẫu lạc không nhiễm aflatoxin, (b) Sắc ký đồ của

mẫu lạc không nhiễm aflatoxin được thêm chuẩn aflatoxin...................... 76

Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho

qua cột từ 0,625 ng đến 10 ng và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ

trên nền mẫu lạc ...................................................................................... 77

Hình 3.17 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho

qua cột và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ trên nền mẫu lạc ............ 79

Hình 3.18 (a) Sắc ký đồ của mẫu cam thảo không nhiễm aflatoxin, (b) Sắc ký đồ

của mẫu cam thảo không nhiễm aflatoxin thêm 10 ng chuẩn aflatoxin..... 81

Hình 3.19 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho

qua cột từ 0,625 ng đến 10 ng và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ

nền mẫu cam thảo.................................................................................... 82

Hình 3.20 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho

qua cột và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ trên nền mẫu cam thảo.. 84

Hình 3.21 (a) Sắc ký đồ của mẫu gừng không nhiễm aflatoxin, (b) Sắc ký đồ của

mẫu gừng không nhiễm aflatoxin được thêm 10 ng chuẩn aflatoxin......... 87

Hình 3.22 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho

qua cột từ 0,625 ng đến 10 ng và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ

trên nền mẫu gừng ................................................................................... 88

Hình 3.23 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho

qua cột và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ trên nền mẫu gừng......... 90

Hình 3.24 Sắc ký đồ của mẫu cà phê làm sạch bằng cột IAC và cột SPE C18 ........... 93

Hình 3.25 Sắc ký đồ so sánh độ chọn lọc giữa hai phương pháp làm sạch mẫu

bằng cột SPE C18 và cột IAC trên một số nền mẫu thực phẩm ................. 94

Hình 3.26 Sắc ký đồ của một số mẫu dược liệu và thuốc đông dược được làm

sạch bằng phương pháp IAC.................................................................... 96

Hình 3.27 Sắc ký đồ của một số mẫu dược liệu và thuốc đông dược được làm

sạch bằng phương pháp SPE C18.............................................................. 97

- xiii -

Hình 3.28 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng AFB1 thu được

sau khi qua cột Vicam và cột Pasteur..................................................... 100

Hình 3.29 So sánh hiệu suất thu hồi AFB1 thu được sau cột Vicam và cột Pasteur . 100

Hình 3.30 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng AFB2 thu được

sau khi qua cột Vicam và cột Pasteur..................................................... 101

Hình 3.31 So sánh hiệu suất thu hồi AFB2 thu được sau cột Vicam và cột Pasteur . 101

Hình 3.32 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng AFG1 thu được

sau khi qua cột Vicam và cột Pasteur..................................................... 102

Hình 3.33 So sánh hiệu suất thu hồi AFG1 thu được sau cột Vicam và cột Pasteur. 102

Hình 3.34 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng AFG2 thu được

sau khi qua cột Vicam và cột Pasteur..................................................... 103

Hình 3.35 So sánh hiệu suất thu hồi AFG2 thu được sau cột Vicam và cột Pasteur. 103

Hình 4.1 Các u hạt gây ra do tá chất Freund ......................................................... 108

Hình 4.2 Vị trí cộng hợp BSA vào phân tử AFB1 ................................................. 110