Nghiên cứu xác định tần số alen, tần số kiểu gen của gen mã hóa ỏS1-casein có liên quan đến chất lượng sữa ở một số giống dê nuôi tại Việt Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bé gi¸o dôc ®µo t¹o ViÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ ViÖt Nam

VIÖN SINH TH¸I Vµ TµI NGUY£N SINH VËT

…………..o0o…………..

NguyÔn Hïng Thanh

Nghiªn cøu x¸c ®Þnh tÇn sè alen, tÇn sè kiÓu gen cña gen

m· hãa αS1-casein cã liªn quan ®Õn chÊt l-îng s÷a ë mét

sè gièng dª nu«i t¹i ViÖt Nam.

Chuyªn ngµnh: Sinh häc thùc nghiÖm

M· sè: 60 42 30

LuËn ¸n th¹c sü sinh häc

Ng-êi h-íng dÉn khoa häc

TS. NguyÔn Anh

Hà Nội, 2010

NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12

1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các số

liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố

trong bất kỳ công trình nào khác tại Việt Nam.

NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12

2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Lêi c¶m ¬n

Để có thể hoàn thành luận văn này, trƣớc tiên, tôi muốn bày tỏ lỏng biết

ơn sâu sắc tới Chủ nhiệm đề tài TS. Nguyễn Anh - Phòng Sinh học tế bào

sinh sản Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

đã định hƣớng nghiên cứu, trực tiếp hƣớng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi

trong suốt thời gian nghiên cứu.

Tôi cũng mong muốn đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban lãnh

đạo và cán bộ Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt

Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và cơ sở vật chất giúp tôi

hoàn thành nghiên cứu này.

Tôi muốn đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các cán bộ Phòng

Sinh học tế bào sinh sản - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công

nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện để tôi thực hiện đề tài.

Tôi xin đƣợc cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Phòng Miễn dịch

học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và

Trung tâm Nghiên cứu Dê và Thỏ Sơn Tây - Ba Vì - Hà Nội

Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban lãnh đạo và Phòng

Đào tạo Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Khoa học và Công

nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại viện.

Qua đây, tôi muốn đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô

giáo tham gia giảng dạy lớp cao học K12 - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh

vật - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và trang bị những

kiến thức hữu ích cho tôi trong suốt thời gian học tập tại viện.

NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12

2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Đề tài luận văn đƣợc thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài “Nghiên

cứu xác định tần số alen, tần số kiểu gen của gen mã hóa ỏS1-casein có

liên quan đến chất lượng sữa ở một số giống dê nuôi tại Việt Nam”.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè,

những ngƣời đã luôn cổ vũ, động viên tôi vƣợt qua mọi khó khăn trong quá

trình học tập và nghiên cứu.

Hµ Néi, ngµy 01 th¸ng 01 n¨m 2011

Häc viªn

NguyÔn Hïng Thanh

NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12

1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỞ ĐẦU .................................................................................................................................

Chƣơng 1 ...............................................................................................................................1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................................................1

1.1. TÌNH HÌNH CHĂN NUÔI DÊ ..................................................................................1

1.1.1. Tình hình chăn nuôi dê trên thế giới....................................................................1

1.1.2. Tình hình chăn nuôi dê ở Việt Nam.....................................................................3

1.2. ĐẶC ĐIỂM SỮA DÊ .................................................................................................4

1.2.1. Thành phần protein ..............................................................................................4

1.2.1.1. Whey protein.....................................................................................................4

1.2.1.2. Casein................................................................................................................5

1.2.1.3. Các protein hàm lƣợng thấp..............................................................................8

1.2.2. So sánh sữa dê với các loại sữa khác ...................................................................8

1.2.3. Giá trị dinh dƣỡng của sữa dê............................................................................12

1.3. PHƢƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG CHỌN GIỐNG DÊ SỮA Ở VIỆT NAM....13

1.3.1. Chọn giống dê sữa cái hƣớng sữa ......................................................................13

1.3.1.1. Ngoại hình.......................................................................................................13

1.3.1.2. Khả năng tiết sữa ............................................................................................14

1.3.1.3. Phẩm chất chăn nuôi.......................................................................................14

1.3.1.4. Dòng giống .....................................................................................................14

1.3.2. Chọn dê đực giống hƣớng sữa ...........................................................................14

1.3.2.1. Ngoại hình.......................................................................................................14

1.3.2.2. Dòng giống .....................................................................................................15

1.3.2.3. Phẩm chất chăn nuôi.......................................................................................15

1.3.2.4. Khả năng thụ tinh............................................................................................15

1.4. PHƢƠNG PHÁP CHỌN GIỐNG DÊ SỮA DỰA VÀO CÁC CHỈ TIÊU SINH LÝ,

HÓA SINH ......................................................................................................................15

1.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHỌN GIỐNG VẬT

NUÔI ...............................................................................................................................17

1.5.1. Microsatellite .....................................................................................................17

1.5.2. RAPD.................................................................................................................18

1.5.3. RFLP..................................................................................................................18

1.5.4. AFLP..................................................................................................................19

1.6. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH GEN CSN1S1 Ở DÊ...............20

1.6.1. Phân tích protein ................................................................................................20

1.6.1.1. Điện di điểm đẳng điện (IEF) .........................................................................20

1.6.1.2. Điện di mao quản (CZE).................................................................................21

1.6.1.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC).............................................23

1.6.2. Phân tích ADN...................................................................................................24

1.6.2.1. AS-PCR ..........................................................................................................24

1.6.2.2. PCR-RFLP......................................................................................................25

1.6.2.3. Realtime-PCR.................................................................................................26

1.7. NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN CSN1S1 CỦA DÊ .........................26

1.7.1. Đặc điểm di truyền của gen CSN1S1 của dê .....................................................27

1.7.2. Ứng dụng của các nghiên cứu đa hình di truyền gen CSN1S1của dê ...............29

Chƣơng 2 .............................................................................................................................34

NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12

2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................................34

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ..............................................................................................34

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................................34

2.1.1.1. Dê Alpine........................................................................................................34

2.1.1.2. Dê Saanen .......................................................................................................36

2.1.2. Mẫu nghiên cứu ................................................................................................37

2.1.3. Các hóa chất và bộ kit........................................................................................38

2.1.4. Dụng cụ và trang thiết bị....................................................................................38

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................................................................39

2.2.1. Xác định kiểu gen các cá thể .............................................................................39

2.2.1.1. Tách chiết ADN tổng số .................................................................................39

2.2.1.2. Thiết kế mồi và thực hiện phản ứng AS - PCR phân biệt alen E và alen non-E

.....................................................................................................................................40

2.2.1.3. Thực hiện phản ứng PCR-RFLP phân biệt các alen non-E ...........................43

2.2.1.4. Kỹ thuật phát hiện sản phẩm của phản ứng PCR ...........................................45

2.2.2. Định lƣợng một số thành phần của sữa dê.........................................................47

2.2.3. Thống kê sinh học..............................................................................................48

Chƣơng 3 ............................................................................................................................49

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN......................................................................49

3.1. XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CSN1S1 CỦA CÁC MẪU NGHIÊN CỨU .....................49

3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ 64 mẫu máu dê sữa ................................................49

3.1.2. Kết quả AS-PCR với cặp mồi (CEX19F-CEX19R -CEX19L) .........................50

3.1.3. Kết quả PCR-RFLP với cặp mồi (XR-XF)........................................................51

3.1.4. Tần số kiểu gen..................................................................................................52

3.1.4.1. Tần số kiểu gen của dê Alpine........................................................................52

3.1.4.2. Tần số kiểu gen của dê Saanen .......................................................................55

3.1.4. Tần số alen.........................................................................................................59

3.1.4.1. Tần số alen của dê Alpine...............................................................................59

3.1.4.2. Tần số alen của dê Saanen ..............................................................................60

3.2. CÁC CHỈ TIÊU HÓA SINH CỦA SỮA DÊ ...........................................................62

3.2.1. Phân tích các chỉ tiêu hóa sinh của sữa dê.........................................................62

3.2.1.1. Hàm lƣợng protein trong sữa ..........................................................................62

3.2.1.2. Hàm lƣợng casein trong sữa ...........................................................................64

3.2.1.3. Hàm lƣợng lipid trong sữa ..............................................................................65

3.2.1.4. Hàm lƣợng lactose trong sữa ..........................................................................66

3.2.2. Phân tích các chỉ tiêu hóa sinh sữa các kiểu gen CSN1S1 ................................68

3.2.3. Phân tích các chỉ tiêu hóa sinh sữa của hai giống dê nghiên cứu ......................72

KẾT LUẬN......................................................................................................................74

KIẾN NGHỊ.....................................................................................................................75

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................................77

NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12

1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

AE Elution buffer

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism PCR

AL Lysis Buffer

AS-PCR Allele specific polymerase chain reaction

(PCR đặc hiệu alen)

ATL Tissue Lysis Buffer

AW Wash buffer

CZE Capillary zone electrophoresis

(Điện di mao quản)

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

Gen CSN1S1 Gen mã hóa alpha-S1-casein

IEF Isoelectric focusing

(Điện di điểm đẳng điện)

KCal KiloCalo

KJ KiloJun

LINE Long interspersed nuclear elements

(Các yếu tố rãi rác có kích thƣớc dài)

RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA

RE Restriction Enzyme

(Enzyme cắt giới hạn)

RFLP Restriction length fragment polymorphism

RP-HPLC Reversed Phase-High Performance Liquid Chromatographic

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo)

Rpm Revolutions per minute

(Vòng/phút)

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis

Taq Thermus aquaticus

NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12

2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC BẢNG

Chƣơng 1

Bảng 1.1. So sánh thành phần sữa dê, sữa bò, sữa ngƣời 11

Bảng 1.2. Thành phần amino acid của các loại sữa 13

Bảng 1.3. Giá trị phần trăm diện tích pic so với phân đoạn casein tổng

số của các kiểu gen đã đƣợc xác định trƣớc 25

Bảng 1.4. Giá trị phần trăm diện tích pic so với phân đoạn casein tổng

số của các kiểu gen đã đƣợc xác định trƣớc 25

Bảng 1.5. Thuộc tính của sữa của các kiểu gen và quá trình chế biến

pho mát 34

Bảng 1.6. Chỉ số cảm quan của pho mát 34

Chƣơng 3

Bảng 3.1. Kiểu gen các cá thể dê nghiên cứu 54

Bảng 3.2. Thành phần kiểu gen của nhóm cá thể dê Alpine nghiên cứu 56

Bảng 3.3. Kiểu gen của các cá thể dê Alpine nghiên cứu 57

Bảng 3.4. Thành phần kiểu gen của nhóm cá thể dê Saanen nghiên cứu 58

Bảng 3.5. Tần số alen và tần số kiểu gen của nhóm cá thể dê Alpine 60

Bảng 3.6 Tần số alen và tần số kiểu gen của nhóm cá thể dê Saanen 61

Bảng 3.7. Hàm lƣợng protein trong sữa của các kiểu gen nghiên cứu 63

Bảng 3.8. Hàm lƣợng casein trong sữa của các kiểu gen nghiên cứu 65

Bảng 3.9. Hàm lƣợng lipid trong sữa của các kiểu gen nghiên cứu 66

Bảng 3.10. Hàm lƣợng lactose trong sữa của các kiểu gen nghiên cứu 67

Bảng 3.11. Các chỉ tiêu chất lƣợng sữa của các kiểu gen của dê Alpine 69

Bảng 3.12. Các chỉ tiêu chất lƣợng sữa của các kiểu gen của dê

Saanen 70

Bảng 3.13. Chỉ tiêu chất lƣợng sữa ở hai giống dê sữa Alpine và

Saanen của Italia 71

NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12

3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 3.14. Các chỉ tiêu chất lƣợng sữa có ảnh hƣởng tới sản xuất pho

mát 72

DANH MỤC HÌNH

Chƣơng 1

Hình 1.1. Điện di đồ SDS-PAGE của casein sữa 9

Hình 1.2. Cấu tạo một micelle casein 10

Hình 1.3. Điện di điểm đẳng điện với gradient pH 2,5-5,0 và 4,0-6,5 các

mẫu sữa 23

Hình 1.4. Hình ảnh điện di mao quản của các mẫu sữa 24

Hình 1.5. Sắc ký đồ RP-HPLC của các mẫu casein đã đƣợc phân tích

trƣớc đó bằng IEF và PCR 26

Hình 1.6. Đồ thị tín hiệu huỳnh quang và nhiệt độ của phản ứng

Realtime-PCR

28

Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc gen CSN1S1 của dê và bò, gen CSN1S1 dài

17,5 kb, bao gồm 19 exon 29

Hình 1.8. Sơ đồ quá trình đột biến tạo thành các alen CSN1S1 34

Chƣơng 2

Hình 2.1. Dê Alpine 36

Hình 2.2. Bản đồ phân bố dê Alpine 37

Hình 2.3. Dê Saanen 38

Hình 2.4. Bản đồ phân bố dê Saanen 39

Hình 2.5. Trình tự phân đoạn của gen CSN1S1 và vị trí các primer 43

Hình 2.6. Kiểu mẫu của alen E của CSN1S1 locut thực hiện bằng AS￾PCR 44

Hình 2.7. Phân tích kiểu gen của các đối tƣợng quan sát bằng phƣơng

pháp XmnI PCR-RFLP 46

Hình 2.8. Các bƣớc đúc gel agarose 47

NguyÔn Hïng Thanh LuËn ¸n th¹c sü kho¸ 12

4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 2.9. Sơ đồ lắp đặt máy chạy điện di ADN 49

Chƣơng 3

Hình 3.1. Điện di đồ ADN tổng số tách từ mẫu máu dê 51

Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR của cá thể có kiểu gen A*A*, A*E

và EE 52

Hình 3.3. Điện di đồ các cá thể có alen non-E 53

Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm PCR cắt bằng enzyme XmnI. 54

Hình 3.5. Tần số các kiểu gen của nhóm cá thể dê Alpine 56

Hình 3.6. Tần số các kiểu gen của nhóm cá thể dê Alpine 59

Hình 3.7. Tần số alen của nhóm cá thể dê Alpine nghiên cứu 61

Hình 3.8. Tần số alen nhóm cá thể dê Saanen nghiên cứu 62

Hình 3.9. Biểu đồ tần số alen của 2 giống dê nghiên cứu 63

Hình 3.9. Biểu đồ so sánh hàm lƣợng protein trong sữa của các kiểu

gen

64

Hình 3.11. Biểu đồ so sánh hàm lƣợng casein trong sữa của các kiểu

gen 66

Hình 3.12. Biểu đồ so sánh hàm lƣợng lipid trong sữa của các kiểu gen 67

Hình 3.13. Biểu đồ so sánh hàm lƣợng lactose trong sữa của các kiểu

gen 68

Hình 3.14. Biểu đồ so sánh các chỉ tiêu chất lƣợng sữa của các kiểu gen

CSN1S1 của dê Alpine 69

Hình 3.15. Biểu đồ so sánh các chỉ tiêu chất lƣợng sữa của các kiểu gen

CSN1S1 của dê Saanen 70

Hình 3.16. Biểu đồ so sánh các chỉ tiêu chất lƣợng sữa của 2 giống dê 72