Nghiên Cứu Xác Định Một Số Đoạn Adn Mã Vạch Và Nhân Giống Lan Phi Điệp Tím Hòa Bình Dendrobium Anosmun Lindley Bằng Kỹ Thuật Nuôi Cấy Mô Tế Bào

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

----------------------------

LUẬN VĂN THẠC SỸ KH

OA HỌC LÂM NGHIỆP

ĐỖ QUỲNH LIÊN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐOẠN ADN MÃ VẠCH

VÀ NHÂN GIỐNG LAN PHI ĐIỆP TÍM HÒA BÌNH

(Dendrobium anosmun Lindley) BẰNG KỸ THUẬT

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

CHUYÊN NGHÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ NGÀNH: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. TS. BÙI THỊ MAI HƯƠNG

2. PGS.TS. NGUYỄN VĂN VIỆT

Hà Nội, 2020

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu kết

quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất

kỳ công trình nghiên cứu nào khác.

Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bất kỳ công trình nghiên

cứu nào đã công bố, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ kết luận

đánh giá luận văn của hội đồng khoa học.

Hà nội, ngày….. tháng….. Năm 2020

Người cam đoan

( Tác giả ký và ghi rõ họ tên)

Đỗ Quỳnh Liên

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, Viện Công nghệ

sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp đã trang bị kiến thức cho

tôi trong suốt quá trình học tập.

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Văn

Việt và TS. Bùi Thị Mai Hương đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong

suốt quá trình làm luận văn Thạc sĩ này.

Tôi xin cảm ơn các cán bộ Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp -

Trường Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp

đã luôn sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong quá

trình học tập và nghiên cứu.

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Học viên

Đỗ Quỳnh Liên

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................i

LỜI CẢM ƠN..................................................................................................ii

MỤC LỤC.......................................................................................................iii

BẢNH DANH MỤC VIẾT TẮT...................................................................vi

DANH MỤC CÁC BẢNG ...........................................................................viii

DANH MỤC CÁC HÌNH............................................................................... x

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1

Chương 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ................................... 3

1.1. Giới thiệu chung về cây Phi điệp tím Hòa Bình .................................. 3

1.1.1. Nguồn gốc, phân loại.................................................................... 3

1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Phi điệp tím Hòa Bình................ 4

1.1.3. Một số điều kiện sinh thái ............................................................. 5

1.1.4. Giá trị sử dụng ............................................................................. 6

1.2. Tổng quan về ADN mã vạch ............................................................... 7

1.2.1. Giới thiệu về ADN mã vạch (DNA barcode) ................................ 7

1.2.2. Một số locus được sử dụng làm chỉ thị mã vạch ADN ở thực vật ... 10

1.2.3.Những nghiên cứu về ứng dụng ADN mã vạch trong giám định loài.. 13

1.3. Tổng quan về nuôi cấy mô - tế bào.................................................... 16

1.3.1. Cơ sở của khoa học của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật 16

1.3.2. Các bước tiến hành của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật.17

1.3.3. Thành tựu trong nuôi cây mô đối với chi Dendrobium........................19

Chương 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU............................................................................................... 23

2.1. Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................... 23

2.1.1. Mục tiêu tổng quát ...................................................................... 23

2.1.2. Mục tiêu cụ thể............................................................................ 23

2.2. Nội dung nghiên cứu.......................................................................... 23

iv

2.2.1. Xác định một số trình tự ADN mã vạch ...................................... 23

2.2.2. Nhân giống Phi điệp tím Hòa Bình bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào . 23

2.3. Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu.................. 23

2.3.1. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................... 23

2.3.2. Hóa chất...................................................................................... 24

2.4. Phương pháp nghiên cứu xác đinh ADN mã vạch ........................... 26

2.4.1.Tách chiết DNA tổng số ............................................................... 26

2.4.2. Phương pháp nhân bản gen đích của kỹ thuật PCR................... 28

2.4.3.Tinh sạch sản phẩm PCR............................................................. 29

2.4.4. Phương pháp đọc trình tự........................................................... 30

2.4.5. Xử lý số liệu................................................................................. 30

2.5. Phương pháp nhân giống Phi điệp tím Hòa Bình bằng kỹ thuật nuôi

cấy mô tế bào ............................................................................................ 30

2.5.1. Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch và nuôi cấy khởi động ... 30

2.5.2. Phương pháp nhân nhanh thể chồi............................................. 31

2.5.3. Phương pháp nhân nhanh chồi................................................... 32

2.5.4. Phương pháp nghiên cứu ra rễ - tạo cây hoàn chỉnh................. 34

2.5.5. Phương pháp huấn luyện và ra ngôi........................................... 35

2.5.6. Điều kiện thí nghiệm ................................................................... 36

2.5.7.Chỉ tiêu theo dõi, đánhgiá............................................................ 36

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................ 37

3.1. Kết quả xác định một số đoạn ADN mã vạch.................................... 37

3.1.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số.................................................. 37

3.1.2. Kết quả nhân bản vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR...... 37

3.1.3. Phân tích kết quả ........................................................................ 38

3.2. Kết quả nhân giống cây Phi điệp tím Hòa Bình bằng nuôi cấy mô tế bào...52

3.2.1. Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch và nuôi cấy khởi động... 52

3.2.2. Phương pháp nhân nhanh thể chồi............................................. 55

v

3.2.3. Phương pháp nhân nhanh chồi................................................... 57

3.2.4. Phương pháp nghiên cứu ra rễ - tạo cây hoàn chỉnh................. 63

3.2.5. Phương pháp huấn luyện và ra ngôi........................................... 65

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................... 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 69

vi

BẢNH DANH MỤC VIẾT TẮT

TT Chữ viết tắt Giải nghĩa

1 ADN Deoxyribonucleic Acid

2 IBA Indol Butyric Acid

3 MS Murashige và Skoog(1962)

4 NAA a- Naphthalen acetic acid

5 CTTN Công thức thí nghiệm

6 ĐHST Điều hòa sinh trưởng

7 BAP 6 -benzynlaminopurin

8 Knops Knops Medium

9 ĐC Đối chứng

10 TB Trung Bình

11 TG Thời gian

12 CTAB Cetyl trimethylammonium bromide

13 PCR Phản ứng chuỗi polymerase

14 EDTA axit ethylenediamine tetraacetic

15 IAA Indol- acetic acid

16 WPM Woody plant medium

17 GA3 Gibberellin A3

18 NCBI

Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ

sinh học

19 bp Cặp base

20 ITS Vùng AND nằm giữa các gen

vii

TT Chữ viết tắt Giải nghĩa

21 IAE Tris-Acetate-EAIA

22 EBA Đệm tách A

23 EBB Đệm tách B

24 SOS Sodium Đoecyl Sulphate

25 UV Tia cực tím

26 ddNTP Dideoxy nucleotide