Nghiên Cứu Xác Định Các Đoạn Adn Mã Vạch Cho Cây Râu Mèo Orthosiphon Aristatus Ở Việt Nam Phục Vụ Cho Giám Định Loài

i

C

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và rèn luyện tại Trường Đại học Lâm

Nghiệp, để vượt qua những khó khăn, thử thách và đạt được những kết quả mong muốn

trong học tập cũng như cuộc sống, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi còn nhận được

những sự quan tâm, giúp đỡ từ thầy cô, gia đình và bạn bè.

Nhân dịp này, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy cô

giáo đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy tôi suốt quá trình học tập, nghiên cứu và rèn

luyện tại Trường Đại học Lâm nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Bùi Văn Thắng, Th.S Nguyễn Thị Huyền

đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong quá trình hoàn thành khóa luận. Với những

kiến thức và kỹ năng thầy, cô truyền dạy không chỉ giúp tôi hoàn thành khóa luận mà

còn là tài sản quý báu theo giúp tôi sau này.

Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học

Lâm Nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi có một

môi trường tốt để học tập, nghiên cứu và rèn luyện.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến các thầy cô, gia đình, bạn

bè - những người đã động viên, khích lệ tôi suốt quá trình học tập, rèn luyện và thực

hiện khóa luận tốt nghiệp.

Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thành bài khóa luận một cách hoàn chỉnh

nhất, song vẫn không thể tránh khỏi những thiếu sót. Do vậy, tôi rất mong được sự góp

ý của các thầy cô và các bạn để kiến thức của tôi được hoàn thiện hơn.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Sinh viên thực hiện

oàn Thu ải

ii

ỤC ỤC

L I C M N ........................................................................................................i

MỤC LỤC.............................................................................................................ii

D NH MỤC TỪ VI T T T...............................................................................iv

D NH MỤC CÁC B NG.................................................................................... v

D NH MỤC CÁC HÌNH.................................................................................... vi

ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................... 1

CH NG 1. T NG QU N T I LI U............................................................... 3

1.1 T ng quan về đôi tượng nghiên cứu ............................................................... 3

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại............................................................................... 3

1.1.2. Đặc điểm hình thái ...................................................................................... 3

1.1.3. Đặc điểm về sinh thái và phân bố ............................................................... 4

1.1.4. Thành phần hóa học .................................................................................... 5

1.1.5. Tác dụng dược lý......................................................................................... 5

1.2. T ng quan về DN mã vạch DNA barcode)................................................ 8

1.2.1. Giới thiệu về DN mã vạch........................................................................ 8

1.2.2. Các đặc điểm cơ bản của trình tự DN barcode ........................................ 9

1.2.3. Một số locus được sử dụng trong phương pháp DNA barcode ............... 11

1.2.4. Những nghiên cứu về ứng dụng mã vạch ADN trong giám định loài. .. 17

CH NG 2. MỤC TI U, N I DUNG, V T LI U V PH NG PHÁP

NGHI N CỨU.................................................................................................... 23

2.1. Mục tiêu nghiên cứu..................................................................................... 23

2.2. Nội dung nghiên cứu.................................................................................... 23

2.3. Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu............................ 23

2.3.1.Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 23

2.3.2. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu .......................................................... 24

2.3.3. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ...................................................... 25

2.4. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................. 26

iii

2.4.1. Tách chiết DN t ng số............................................................................ 26

2.4.2. Phương pháp PCR với mồi đặc hiệu......................................................... 28

2.4.3. Tinh sạch sản phẩm PCR .......................................................................... 31

CH NG 3. K T QU NGHI N CỨU V TH O LU N............................ 33

3.1. Kết quả tách chiết DN t ng số .................................................................. 33

3.2. Kết quả PCR nhân gen với mồi đặc hiệu ..................................................... 33

3.2.1. Kết quả nhân bản đoạn gen rpoB với cặp mồi đặc hiệu ........................... 34

3.2.2. Kết quả nhân bản đoạn gen trnL-trnF với cặp mồi đặc hiệu..................... 35

3.3. Kết quả phân tích trình tự đoạn gen rpoB.................................................... 35

3.3.1. Trình tự đoạn gen rpoB............................................................................. 35

3.3.2. Kết quả so sánh trình tự gen rpoB với các trình tự trong Ngân hàng gen

NCBI ................................................................................................................... 36

3.3.3. Kết quả xây dựng cây phát sinh dựa trên trình tự gen rpoB..................... 38

3.4. Kết quả phân tích trình tự gen trnL-trnF...................................................... 41

3.4.1. Trình tự gen trnL-trnF phân lập được từ cây Râu mèo............................. 41

3.4.2. Kết quả so sánh trình tự gen trnL- trnF với các trình tự trong Ngân hàng

gen NCBI............................................................................................................. 42

3.4.3. Kết quả xây dựng cây phát sinh dựa trên trình tự gen trnL- trnF ............. 44

K T LU N V KI N NGH ............................................................................. 48

T I LI U TH M KH O

iv

DANH ỤC T T T T

Các chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

ATP Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat

BME β-mereaptoethanol β-mereaptoethanol

BOLD Barcode of Life data Barcode of Life data

bp Base pair Cặp base

CBOL Consortium for the Barcode of Life Consortium for the Barcode of Life

cpDNA Chloroplast DNA bộ gen lục lạp

CTAB Cetyl trimethylammonium bromide Cetyl trimethylammonium bromide

Cytb Cytochrome b Cytochrome b

DNA (ADN) Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate Deoxyribonucleotid triphosphate

EBA Extraction Buffer A Đệm tách

EBB Extraction Buffer B Đệm tách B

F-Primer Foward-Primer Mồi xuôi

ITS Internal Transcribed Spacer vùng DN nằm giữa các gen

kb Kilobase (1000 base) 1000 cặp base

NAD(P)H

Nicotinamide adenine dinucleotide

phosphate

Nicotinamide adenine dinucleotide

phosphate

NCBI National Center for Biotechnology

Information

Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công

nghệ sinh học

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase

PVP Polyvinyl pyrrolidone Polyvinyl pyrrolidone

RFLP

Restriction fragment length

polymorphism

Phân tích đa hình trình tự DN

RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic

rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome

SDS Sodium Dodecyl Sulphate Sodium Dodecyl Sulphate

R-Primer Reverse primer Mồi ngược

TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA

tRNA Transfer RNA RN vận chuyển

v

DA ỤC CÁC B G

Bảng 1.2. Thông tin của một số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục

lạp........................................................................................................................ 15

Bảng 2.1. Kí hiệu các mẫu Râu mèo sử dụng cho nghiên cứu ........................... 23

Bảng 2.2 Thành phần đệm tách A (100µl).......................................................... 24

Bảng 2.3 Thành phần đệm tách B (100µl).......................................................... 24

Bảng 2.4 Thành phần đệm TE (100µl) ............................................................... 24

Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR................................................................. 29

Bảng 2.6: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen rpoB ................................ 29

Bảng 2.7: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen trnL-trnF ......................... 30

Bảng 2.8. Trình tự và thông tin về cặp mồi ........................................................ 30

Bảng 3.1: Mức độ tương đồng khi so sánh mẫu Râu mèo nghiên cứu với 6 loài

trên ngân hàng gen NCBI.................................................................................... 40

Bảng 3.2: Mức độ tương đồng gen trnL- trnF khi so sánh mẫu Râu mèo nghiên

cứu với 6 loài trên ngân hàng gen NCBI. ........................................................... 47