Nghiên Cứu Xác Định Adn Mã Vạch Cho Loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus Formosanus Hayata

i

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành chuyên đề này, em xin chân thành cảm ơn Th.S Nguyễn Thị

Thơ là cố vấn học tập đã tận tình giúp đỡ em hoàn thành tốt khóa học, hƣớng dẫn

và giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, các cô và các anh chị đang làm

việc và công tác tại Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp, Trƣờng Đại học Lâm

Nghiệp đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới gia đình bạn bè đã luôn ủng hộ

động viên tinh thần để tôi hoàn thành báo cáo này

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Lê Công Mạnh

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................i

MỤC LỤC.............................................................................................................ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .....................................................................iv

ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU....................................... 3

1.1. Tổng quan về cây Lan kim tuyến................................................................... 3

1.1.1 Đặc điểm phân loại và vị trí phân bố cây Lan kim tuyến ............................ 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái và sinh trƣởng............................................................... 6

1.1.3 Giá trị dƣợc liệu của cây Lan kim tuyến...................................................... 7

1.2. Tổng quan về mã vạch ADN (DNA barcode)................................................ 9

1.3 Những locus đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp ADN mã vạch ở thực vật .. 12

1.3.1. Trình tự gen nhân ...................................................................................... 12

1.3.2. Trình tự gen lục lạp ................................................................................... 12

1.3.3. Trình tự gen rbcL ...................................................................................... 12

1.3.4. Trình tự gen matK..................................................................................... 13

1.3.5. Trình tự gen ycf5....................................................................................... 13

1.3.6. Trình tự gen rpoB và rpoC1 ...................................................................... 13

1.3.7. Trình tự hai gen trnH-psbA....................................................................... 14

1.3.8. Trình tự hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA) .................................................. 14

1.3.9. Vùng gen mã hóa ribosome....................................................................... 15

1.4 Ứng dụng và những lợi ích của mã vạch ADN............................................. 15

1.5. Ứng dụng mã vạch ADN trên cây dƣợc liệu............................................... 17

1.6. Tình hình nghiên cứu ADN barcode ở thực vật........................................... 19

1.7 Tình hình nghiên cứu mã vạch ADN cây Lan kim tuyến ............................. 20

CHƢƠNG 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

............................................................................................................................. 23

2.1. Mục tiêu nghiên cứu..................................................................................... 23

2.2. Nội dung nghiên cứu tách chiết ................................................................... 23

2.3. Địa điểm thực hiện ....................................................................................... 23

2.4. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu ......................................................... 23

2.4.1 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ............................................................. 23

iii

2.4.2 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu...................................................... 23

2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................... 24

2.5.1 Tách chiết ADN tổng số............................................................................. 24

2.5.2 Kỹ thuật PCR ............................................................................................. 25

2.5.3 Tinh sạch sản phẩm PCR ........................................................................... 26

2.5.4 Giải trình tự gen ......................................................................................... 27

2.5.5 Phƣơng pháp phân tích số liệu ................................................................... 27

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................... 28

3.1 Kết quả tách chiết AND tổng số ................................................................... 28

3.2 Kết quả nhân bản vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR ........................ 28

3.2.1 Kết quả nhân bản đoạn gen matK .............................................................. 29

3.2.2 Kết quả nhân bản đoạn gen rbcL................................................................ 29

3.2.3 Kết quả nhân bản đoạn gen trnH-psbA...................................................... 30

3.2.4. Kết quả nhân bản đoạn gen ITS2 ............................................................. 31

3.3 Phân tích kết quả ........................................................................................... 31

3.3.1. Xác định, phân tích trình tự gen................................................................ 31

3.3.2. So sánh khả năng phân biệt trình tự matK, rbcL và ITS2 của mẫu LKT với

loài A. albolineatus.............................................................................................. 42

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KHUYẾN NGHỊ............................. 44

4.1. Kết luận ........................................................................................................ 44

4.2 Tồn tại............................................................................................................ 44

4.3 Kiến nghị....................................................................................................... 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... 45

iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Các từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

bp Cặp base

CBOL Tổng hợp các mã vạch của sự sống

cpDNA bộ gen lục lạp

Cytb Cytochrome b

DNA (ADN) Axit deoxyribonucleic

EDTA axit ethylenediamine tetraacetic

F-Primer Mồi xuôi

IGS vùng liên gen

ITS vùng DNA nằm giữa các gen

kb 1000 cặp base

NCBI Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học

PCR Phản ứng chuỗi polymerase

PVP Polyvinyl pyrrolidone

R- Primer Mồi ngƣợc

RAPD Sự khuếch đại ngẫu nhiên của DNA đa hình

RFLP Phân tích đa hình trình tự DNA

RNA Axit ribonucleic

rRNA ARN ribosome

LKT Mẫu Lan kim tuyến

TAE Tris-Acetate-EDTA

tRNA ARN vận chuyển

UV Tia cực tím

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu .............................................. 24

Bảng 2.2. Thành phần 1 phản ứng PCR.............................................................. 26

Bảng 2.3. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR..................................................... 26

Bảng 3.1: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen matK của mẫu lan kim tuyến

nghiên cứu với một số loài trên Ngân hàng gen ................................................. 32

Bảng 3.2: Các vị trí sai khác vùng gen matK lan kim tuyến với 7 mã gen khác 36

Bảng 3.3: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen rbcL của mẫu lan kim tuyến nghiên

cứu với một số loài trên Ngân hàng gen ............................................................. 37

Bảng 3.4: Các vị trí sai khác vùng gen rbcL lan kim tuyến với 5 mã gen khác

trên ngân hàng gen .............................................................................................. 39

Bảng 3.5. Một số loài có trình tự gen ITS2 tƣơng đồng với trình tự gen ITS2 của

mẫu LKT trên ngân hàng gen NCBI.................................................................. 40

Bảng 3.6: Các vị trí sai khác dùng để phân loại của đoạn gen vùng gen ITS2... 41

Bảng 3.7. Bảng so sánh khả năng phân biệt của đoạn trình tự ........................... 42