Nghiên cứu thiết kế và chuyển gen AGPopt tổng hợp nhân tạo vào cây sắn (Manihot esculenta Crantz)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỖ HẢI LAN

ẾT KẾ VÀ CHUYỂN GEN

AGPopt TỔNG HỢP NHÂN TẠO

VÀO CÂY SẮN (Manihot esculenta Crantz)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2017

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đỗ Hải Lan

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ CHUYỂN GEN

AGPopt TỔNG HỢP NHÂN TẠO

VÀO CÂY SẮN (Manihot esculenta Crantz)

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Mã số: 62 42 01 12

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. Lê Trần Bình

Viện Công nghệ sinh học

2. PGS.TS. Lê Văn Sơn

Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2017

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Lê Trần Bình và PGS. TS. Lê

Văn Sơn, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam là người thầy tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong

suốt quá trình nghiên cứu thực hiện và hoàn thành luận án này.

Tôi xin cảm ơn lãnh đạo và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật,

Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng Thí nghiệm trọng diểm công nghệ gen,

Ban Lãnh đạo, Phòng Quản lý tổng hợp, bộ phận Quản lý đào tạo sau đại học,

Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về mọi

mặt, hỗ trợ tôi thực hiện các thủ tục cần thiết để tôi có thể hoàn thành chương trình

học tập và nghiên cứu của Nghiên cứu sinh.

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của TS. Hoàng Văn An và

NCS. Võ Thị Xuân Kiều, College of Life Science, Kyung Hee University, Hàn

Quốc trong quá trình tôi thực hiện luận án.

Tôi nhận được sự tạo điều kiện giúp đỡ về mọi mặt từ Ban Giám hiệu, Ban

Chủ nhiệm khoa Sinh - Hóa, Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng Đào tạo sau đại học,

Trường Đại học Tây Bắc trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng

cảm ơn.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, đồng nghiệp

đã luôn động viên và khích lệ tôi trong thời gian qua.

Hà Nội, tháng 11 năm 2017

Tác giả luận án

Đỗ Hải Lan

ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn

khoa học của GS.TS. Lê Trần Bình và PGS. TS. Lê Văn Sơn.

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã

được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho

phép của các đồng tác giả khác. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ

công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2017

Tác giả luận án

Đỗ Hải Lan

iii

MỤC LỤC

Nội dung Trang

MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .......................... 5

1.1. Giới thiệu chung về cây sắn .................................................................. 5

1.1.1. Đặc điểm thực vật học .................................................................... 5

1.1.2. Vai trò và giá trị kinh tế .................................................................. 6

1.1.3. Tình hình phát triển cây sắn ........................................................... 8

1.2. Nghiên cứu nuôi cấy in vitro và hệ thống chuyển gen ở cây sắn... 10

1.2.1. Nghiên cứu chọn tạo giống sắn theo phương pháp truyền thống .... 10

1.2.2. Nghiên cứu nuôi cấy in vitro và tái sinh cây................................... 11

1.2.3. Các nghiên cứu quy trình chuyển gen ở cây sắn ............................. 15

1.2.4. Tạo cây sắn chuyển gen tăng cường hàm lượng tinh bột................. 18

1.3. Tinh bột và quá trình tạo tinh bột ở cây có củ .............................. 23

1.3.1. Giới thiệu về tinh bột ...................................................................... 23

1.3.2. Cơ chế tổng hợp tinh bột ................................................................ 24

1.3.3. Các enzim và gen liên quan tích lũy tinh bột ................................. 26

1.4. Gen tổng hợp biểu hiện trong thực vật ......................................... 31

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 35

2.1. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................... 35

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................ 36

2.2.1. Các phương pháp liên quan đến nuôi cấy mô, tái sinh cây sắn và

chuyển gen..................................................................................... 37

2.2.2. Các phương pháp liên quan đến tổng hợp gen và thiết kế vector

mang gen nhân tạo mã hóa enzyme AGPase phục vụ cho chuyển

gen .......................................................................................... 42

2.2.3. Các phương pháp liên quan đến phân tích các dòng cây chuyển 49

iv

gen ..................................................................................................

2.2.4. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu ..................................... 52

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................................ 53

3.1. Kết quả xây dựng quy trình nuôi cấy và tái sinh cây sắn ............ 53

3.1.1. Kết quả đánh giá khả năng tạo phôi soma ................................... 54

3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng tái sinh của phôi soma ....................... 58

3.2. Kết quả tối ƣu hóa quy trình chuyển gen chỉ thị gus vào cây sắn 62

3.2.1. Tối ưu chủng vi khuẩn A. tumefaciens và vector chuyển gen vào

cây sắn ............................................................................................ 62

3.2.2. Tối ưu vật liệu và phương pháp lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens

vào cây sắn .................................................................................................. 64

3.2.3. Tối ưu thời điểm lây nhiễm và mật độ vi khuẩn A. tumefaciens

cho chuyển gen vào mảnh lá mầm cây sắn KM94 ........................ 66

3.2.4. Tối ưu nồng độ (AS) và thời gian lây nhiễm vi khuẩn A.

tumefaciens .................................................................................... 66

3.2.5. Tối ưu thời gian đồng nuôi cấy .............................................. 68

3.2.6. Tối ưu loại kháng sinh và ngưỡng chọn lọc ............................. 69

3.2.7. Phân tích cây sắn KM94/pCB-gus ........................................... 72

3.3. Kết quả thiết kế vector mang gen mã hóa AGPase ...................... 73

3.3.1. Tổng hợp gen nhân tạo mã hóa AGPase ........................................ 73

3.3.2. Thiết kế vector tái tổ hợp chứa cấu trúc gen AGPopt .................... 77

3.3.3.Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp chứa vector

pBI121/AGPopt đã thiết kế......................................... ..................... 79

3.3.4. Đánh giá sự biểu hiện của gen AGPopt trong cây thuốc lá ......... 80

3.4. Chuyển gen AGPopt vào cây sắn ............................................... 88

3.4.1. Biến nạp gen AGPopt vào cây sắn KM94 nhờ A. tumefaciens

CV58/pGV2260 ............................................................................... 88

3.4.2. Phân tích cây sắn chuyển gen KM94/AGPopt ............................ 90

CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................... 93

v

4.1. Nuôi cấy mô và tái sinh cây sắn phục vụ chuyển gen .................. 93

4.2. Chuyển gen chỉ thị chọn lọc gus vào cây sắn.................................. 99

4.3. Tổng hợp gen nhân tạo AGPopt mã hóa enzyme AGPase và

thiết kế vector pBI121/AGPopt ...................................................... 103

4.4. Chuyển gen AGPopt vào cây sắn KM94 ...................................... 108

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 111

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN

CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ....................................................... 112

SUMMARY ............................................................................................. 113

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................... 117

PHỤ LỤC .................................................................................................

vi

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

Bảng 1.1. Danh mục 5 loại cây chiếm kim ngạch xuất khẩu cao trong

ngành nông nghiệp 2015 ....................................................... 7

Bảng 1.2. Diện tích, năng suất, sản lượng sắn năm 2016 ..................... 9

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của 2,4D, picloram và NAA lên tỉ lệ tạo phôi

soma từ 6 loại vật liệu của 2 giống sắn KM140 và KM94 .... 56

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ picloram tới sự hình thành phôi

soma từ đỉnh chồi và lá non của hai giống sắn KM94 và

KM140 nuôi cấy in vitro ................................................ 58

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của BAP và IBA lên khả năng tạo chồi của phôi

soma từ lá non và đỉnh chồi của 2 giống sắn KM140 và

KM94 ............................................................................ 59

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình tạo chồi từ

phôi soma sau 4 tuần nuôi cấy ............................................ 60

Bảng 3.5. Khả năng tạo rễ của chồi .................................................... 61

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn A. tumefaciens, vector

và loại vật liệu lây nhiễm đến hiệu quả hiệu quả chuyển gen

gus vào cây sắn KM94 và KM140 ....................................... 63

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của phương pháp và các loại vật liệu lây nhiễm

đến hiệu quả chuyển gen gus vào của cây sắn KM94 và

KM140 .............................................................................. 65

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn và thời điểm lây nhiễm đến

hiệu quả chuyển gen gus vào lá mầm cây sắn KM94 .......... 66

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ AS và thời gian lây nhiễm đến hiệu

quả chuyển gen gus vào lá mầm cây sắn KM94 .................. 67

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ AS đến

hiệu quả chuyển gen gus vào lá mầm cây sắn KM94 .......... 68

Bảng 3.11. Ảnh hưởng ngưỡng chọn lọc của kanamycin, neomycin và 70

vii

paromomycin lên hiệu quả chuyển gen gus vào lá mầm cây

sắn KM94 ..........................................................................

Bảng 3.12. Hiệu quả chuyển gen AGPopt vào cây thuốc lá K326 ......... 81

Bảng 3.13. Hàm lượng tinh bột trong lá của cây thuốc lá

K326/pBI121/AGPopt ......................................................... 87

Bảng 3.14. Khả năng tạo tạo chồi và ra rễ của các mẫu sắn KM94

/AGPopt ............................................................................. 90

viii

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

Hình 1.1. Diện tích trồng sắn phân theo vùng kinh tế .......................... 8

Hình 1.2. Cơ cấu sử dụng sắn ở Việt Nam ........................................... 10

Hình 1.3. Sơ đồ các bước tái sinh ở cây sắn ..................................... 12

Hình 1.4. Sơ đồ bốn hệ thống chuyển gen vào cây sắn.......................... 16

Hình 1.5. Các phản ứng sinh tổng hợp tinh bột..................................... 26

Hình 1.6. Các enzim tham gia sinh tổng hợp tinh bột............................ 19

Hình 1.7. Cấu trúc của enzim AGPase................................................... 24

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm .................................................................... 36

Hình 2.2. Sơ đồ các bước thiết kế vector pBI121/AGPopt ................... 42

Hình 2.3. Sơ đồ tổng hợp vector pBI121/AGPopt ............................... 47

Hình 2.4. Sơ đồ các bước tách chiết enzim AGPase ............................ 51

Hình 3.1. Hình ảnh minh họa các bước chuẩn bị, tạo vật liệu khởi đầu

phục vụ tái sinh cây sắn......................................................... 53

Hình 3.2. Các loại vật liệu cho nuôi cấy mô và tái sinh cây sắn ........... 54

Hình 3.3. Hình ảnh mẫu qua các giai đoạn tái sinh cây sắn khác nhau 62

Hình 3.4. Kết quả nhuộm X-gluc với các loại vật liệu lây nhiễm....... 64

Hình 3.5. Số lượng cây KM94/pCB-gus được tạo thành trên môi

trường chọn lọc với các kháng sinh có nồng độ khác nhau ... 72

Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen nptII từ các dòng

sắn chuyển gen ............................................................... 73

Hình 3.7. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen AGPopt và glgC

ở E. coli K12.................................................................. 75

Hình 3.8. Hình 3.8. Kết quả so sánh trình tự protein suy diễn từ gen

AGPopt với glgC (E. coli K12)......................................... 76

Hình 3.9. Sơ đồ cấu trúc gen AGPopt tổng hợp nhân tạo...................... 77

Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng cắt vector pBI121 và

pUCIDT/AGPopt bằng XbaI và SacI ................................ 78

ix

Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch vector pBI121 và

AGPopt (A); điện di sản phẩm colony-PCR gen AGPopt

với cặp mồi đặc hiệu G336 F/G336KDEL R từ vector

pBI121/AGPopt (B).......................................................... 79

Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR gen AGPopt với cặp

mồi đặc hiệu G336F G336KDEL R.................................... 79

Hình 3.13. Kết quả sau khi biến nạp vector pBI121/AGPopt vào A.

tumefaciens và điện di sản phẩm colony-PCR gen AGPopt

từ các dòng khuẩn lạc A. tumefaciens CV58/

pGV2260......................................................................... 80

Hình 3.14. Hình ảnh minh họa một số bước chuyển gen AGPopt bằng

A. tumefaciens CV58/PGV2260 vào cây thuốc lá ................ 81

Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen AGPopt các dòng thuốc lá

chuyển gen.............................................................................. 82

Hình 3.16. Kết quả lai Southern các mẫu thuốc lá chuyển gen

AGPopt........................................................................... 83

Hình 3.17. Kết quả lai Western kiểm tra sự biểu hiện của gen AGPopt

trong các dòng thuốc lá mang gen AGPopt .......................... 85

Hình 3.18. Hoạt tính enzim AGPase trong lá các dòng thuốc lá mang

gen AGPopt và dòng cây không chuyển gen.......................... 86

Hình 3.19. Hình ảnh minh họa kết quả tái sinh cây từ phôi soma

chuyển gen AGPopt của giống sắn KM94.......................... 89

Hình 3.20. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa nptII từ các

dòng cây sắn KM94 chuyển gen............................................ 91

Hình 3.21. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen AGPopt ở các dòng cây

sắn KM94 chuyển gen AGPopt bằng cặp mồi đặc hiệu

G336F/G336KDEL R...................................................... 92

x

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ

2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

AM Apical meristem

AS Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy acetophenone)

BAP 6-benzylaminopurin

bp base pair

CaMV Cauliflower mosaic virus

CBM Cupressus Basal Medium

CIM Callus induction medium

CMML Cassava maturation medium by Li et al. (1996)

COM Callus organogenic medium

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA Ethylene diaminne tetra acetic acid

FEC Friable embryogenic callus

gus β-1,4-glucuronidase

ILL Immature leaf lobe

kb Kilobase

LB Luria bertani

LUC Luciferase

MS Murashige and Skoog medium

NAA 1-naphthaleneacetic acid

nptII neomycin phosphotransferase II

OD Optical density - Mật độ quang

PCR Polymerase chain reaction

RNA Ribonucleic acid

SCV Stable cell volume

TPT Triose phosphate/phosphate translocator

xi

v/p Vòng / phút

WT Wild type

YEB Yeast Extract Beef

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) là cây có củ được trồng ở vùng cận nhiệt

đới của Châu Phi, Châu Á và Châu Mỹ, đáp ứng nhu cầu lương thực cho 800 triệu

người (Paul et al., 2016). Củ sắn có hàm lượng chất khô chiếm 30 - 60% (FAO,

2013) trong đó 80% là tinh bột, được sử dụng chủ yếu làm lương thực, thức ăn chăn

nuôi, công nghiệp tinh bột, đường, nhiên liệu sinh học (Abraham, 1996). Sản phẩm

từ sắn đã trở thành mặt hàng xuất khẩu có giá trị ở nước ta, đạt kim ngạch xuất khẩu

1,32 tỷ USD trong năm 2015. Trong tầm nhìn chiến lược đến năm 2020, Bộ Nông

nghiệp và Phát triển nông thôn (Bộ NN và PTNT) đã xếp cây sắn cùng với lúa và

ngô được ưu tiên phát triển, do vậy, diện tích trồng sắn đến nay đã đạt hơn 570

nghìn ha, tuy nhiên, năng suất sắn của Việt Nam chỉ đạt 19,15 tấn ha ở mức trung

bình của thế giới (Bộ NN và PTNT, 2016).

Để phát triển cây sắn bền vững, cần thiết phải cải tạo giống sắn nhằm không

chỉ thu được lợi nhuận cao mà còn duy trì được độ phì nhiêu của đất. Hiện nay,

trong công tác chọn tạo giống cây trồng, công nghệ gen có ứng dụng công nghệ

nuôi cấy mô, tế bào đã trở thành công cụ hiệu quả để cải biến di truyền của những

cây có hạn chế trong sinh sản hữu tính và được nhân giống vô tính là chủ yếu như

cây sắn. Trên thế giới, nghiên cứu tạo cây sắn chuyển gen đã được bắt đầu từ thập

kỷ 90 của thế kỷ trước và đến nay đã có nhiều thành tựu (Beeching, 2013), đặc biệt

trong hướng cải tiến chất lượng củ như giảm hàm lượng cyanogen (Fregene, 2002;

Taylor et al., 2004), giảm tỷ lệ amylose trong tinh bột (Fregene, 2002), tăng hàm

lượng protein, β-caroten (Morillo et al., 2012; Ovalle et al., 2016), sắt, vitamin

(Fregene, 2002; Taylor et al., 2004; Sayre et al., 2011; Li et al., 2015; Narayanan et

al., 2016), tăng tinh bột (Ihemere et al., 2006)… Việc ứng dụng công nghệ chuyển

gen nhằm tác động vào các gen tham gia quá trình tổng hợp thủy phân tinh bột để

tăng khả năng tích lũy tinh bột ở cơ quan dự trữ hướng đến nâng cao năng suất cây

có củ nói chung và cây sắn nói riêng là hướng nghiên cứu đúng đắn và đang thu hút

2

được sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu.

Trong sinh tổng hợp tinh bột, ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) là

enzim điều hoà quá trình tổng hợp tinh bột ở bước chuyển glucose-1-phosphate

thành ADP-glucose, nguyên liệu để tạo thành tinh bột (Buchanan et al., 2002).

Trong quá trình nghiên cứu, người ta đã phát hiện ra AGPase là sản phẩm đơn gen

của gen glgC của vi khuẩn E.coli, có hoạt tính cao hơn hàng trăm lần so với ở thực

vật (Iglesias et al., 1993). Khi AGPase E. coli mang đột biến điểm G336D thay thế

glycin ở vị trí 336 bằng axit aspartic có thể hoạt động hiệu quả mà không cần chất

hoạt hóa fructose-1,6-bis phosphate, có ái lực cao hơn với cơ chất (ATP và

Glucose-1-phosphate) và giảm ái lực với chất ức chế AMP (Ihemere et al., 2006).

Vì vậy, nuôi cấy mô tái sinh cây sắn, tổng hợp gen nhân tạo AGPopt mã hóa

AGPase với mã di truyền phù hợp với thực vật nhưng có ưu điểm của AGPase ở vi

khuẩn và mang đột biến mong muốn, đánh giá sự biểu hiện của gen tổng hợp trên

cây mô hình đóng vai trò vô cùng quan trọng trong chuyển gen tổng hợp nhân tạo

vào cây sắn góp phần tạo tiền đề cho cải biến năng suất và chất lượng một số giống

sắn đang được trồng phổ biến ở nước ta.

Với những lí do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: ―Nghiên cứu thiết ế v

chuyển gen AGPopt tổng hợp nhân tạo v o cây sắn (Manihot esculenta

Crantz)‖.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Thiết kế và đánh giá hoạt động trên cây mô hình của vector mang gen mã hóa

AGPase đã được tối ưu khả năng biểu hiện trong thực vật (AGPopt) và triển khai

chuyển gen AGPopt vào cây sắn thông qua qui trình tái sinh và chuyển gen vào

giống sắn đang được canh tác tại Việt Nam.

3. Phạm vi nghiên cứu

Về sinh lý học thực vật nghiên cứu hoàn thiện các điều kiện nuôi cấy mô tế

bào, điều kiện tạo phôi soma và tái sinh cây từ phôi soma phục việc chuyển gen ở

cây sắn.