Nghiên Cứu Tách Chiết Và Xác Định Hoạt Tính Sinh Học Chlorogenic Acid Từ Quả Cà Phê Xanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

TRỊNH TRÚC GIANG

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT

TÍNH SINH HỌC Chlorogenic acid

TỪ QUẢ CÀ PHÊ XANH

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ NGÀNH: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. NGUYỄN VIỆT PHƯƠNG

TS. VŨ KIM DUNG

Hà Nội, 2020

i

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện công trình nghiên cứu tôi đã nhận được nhiều

sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo chân tình của các thầy cô, bạn bè và

các cơ quan.

Trước hết cho tôi gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS.

Nguyễn Việt Phương – Trung tâm Công nghệ sinh học, Trường Cao đẳng

Công nghiệp Thực phẩm và TS. Vũ Kim Dung – Bộ môn Công nghệ Vi sinh￾Hóa sinh, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp

Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và định hướng cho tôi trong suốt quá trình

nghiên cứu để hoàn thành bản luận văn này.

Tôi xin cảm ơn tới ban lãnh đạo, các thầy cô giáo thuộc Viện Công

nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp đã giúp đỡ và tạo

điều kiện cho tôi rất nhiều trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin cảm ơn các giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ là chủ tịch hội đồng,

phản biện, thư ký và ủy viên hội đồng đã dành thời gian quý báu để đọc tham

gia hội đồng chấm luận văn với những góp ý cụ thể, những gợi ý bổ ích, giúp

tôi hoàn thiện tốt hơn các nội dung nghiên cứu của luận văn.

Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự khích lệ, động viên và giúp đỡ hết sức

nhiệt tình của gia đình, bè bạn đã dành cho tôi để tôi hoàn thành bản luận văn

nghiên cứu này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Trịnh Trúc Giang

ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu thực sự của cá

nhân tôi và đuợc thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Việt Phương,

Trung tâm Công nghệ sinh học- Trường Cao đẳng Công nghiệp Thực phẩm

và TS. Vũ Kim Dung, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp- Trường Đại học

Lâm nghiệp Việt Nam.

Các số liệu, những kết quả nghiên cứu và kết luận trong luận văn này là

hoàn toàn trung thực, chưa từng được công bố trong bất cứ một công trình

nào khác trước đây. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích

dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo theo đúng yêu cầu.

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Trịnh Trúc Giang

iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN...................................................................................................i

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ii

MỤC LỤC.......................................................................................................iii

DANH MỤC BẢNG........................................................................................ v

DANH MỤC HÌNH........................................................................................vi

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1

Chương 1. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU............................ 3

1.1. Tổng quan về Chlorogenic acid ............................................................. 3

1.1.1. Giới thiệu về Chlorogenic acid....................................................... 3

1.1.2. Công dụng của Chlorogenic acid ................................................... 4

1.2.Tổng quan về cà phê ............................................................................... 8

1.2.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê ở Việt Nam.......................... 8

1.2.2. Cấu tạo quả cà phê xanh............................................................... 10

1.2.3. Thành phần hóa học của quả cà phê ............................................ 11

1.2.4. Cà phê xanh và lợi ích sử dụng..................................................... 13

1.3. Tổng quan về enzyme pectinase .......................................................... 16

1.3.1. Giới thiệu về Enzyme pectinase .................................................... 16

1.3.2. Ứng dụng của enzyme pectinase................................................... 17

1.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất Chlorogenic acid từ cà phê trên thế giới

và ở Việt Nam ............................................................................................. 17

Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH................... 22

2.1. Mục tiêu nghiên cứu............................................................................. 22

2.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................ 22

2.3. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 22

2.3.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................... 22

2.3.2. Hoá chất và thiết bị....................................................................... 22

2.4. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 23

iv

2.4.1. Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết

xuất CGA................................................................................................. 23

2.4.2. Phương pháp tối ưu hoá quá trình chiết xuất CGA...................... 30

2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính CGA thu nhận........................... 32

2.4.4. Phương pháp sấy chân không....................................................... 33

2.4.5. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu ......................................... 33

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 34

3.1. Kết quả xác định các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất CGA 35

3.1.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất : dung môi đến quá trình chiết CGA35

3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình chiết xuất CGA... 37

3.1.3. Ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết xuất CGA........................ 39

3.1.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết xuất CGA................ 40

3.1.5. Kết quả ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình chiết xuất CGA 42

3.1.6. Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến quá trình chiết xuất

CGA……………………………………………………………………………..44

3.2. Kết quả mô hình hoá và tối ưu hoá quá trình chiết xuất CGA ............ 45

3.2.1. Kết quả ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố............... 46

3.2.2. Phân tích phương sai .................................................................... 48

3.2.3. Phương trình hồi quy .................................................................... 49

3.2.4. Tối ưu hóa điều kiện thủy phân cà phê xanh bằng enzyme

pectinase.................................................................................................. 50

3.2.5. Kết quả xác định hàm lượng CGA bằng phương pháp sắc ký lỏng

HPLC....................................................................................................... 52

3.3. Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa ................ 54

3.3.1. Kết quả xác định khả năng kháng khuẩn...................................... 54

3.3.2. Kết quả xác định hoạt tính oxy hóa .............................................. 56

3.4. Kết quả quá trình sấy chân không........................................................ 56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................... 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 61

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cơ chất- dung môi đến quá trình chiết CGA.. 24

Bảng 2.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình chiết xuất CGA. .. 24

Bảng 2.3. Ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết xuất CGA ......................... 25

Bảng 2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết xuất CGA................. 26

Bảng 2.5. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến quá trình chiết xuất CGA .............. 26

Bảng 2.6. Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân đến quá trình chiết xuất CGA27

Bảng 2.7. Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn CGA ............................. 28

Bảng 2.8. Thiết kế chế độ chạy hệ thống HPLC............................................. 29

Bảng 2.9. Bố trí thí nghiệm xây dựng dường chuẩn CGA bằng HPLC ......... 30

Bảng 2.10. Các biến số và khoảng chạy ......................................................... 30

Bảng 2.11. Ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố và hàm lượng

CGA thu được trong các điều kiện thuỷ phân khác nhau ............................... 31

Bảng 2.12. Lượng khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi trên môi trường lỏng............... 32

Bảng 2.13. Thí nghiệm xác định điều kiện sấy chân không ........................... 33

Bảng 3.1. Giá trị nồng độ CGA đo ở bước sóng 324 nm ............................... 34

Bảng 3.2. Ma trận thực nghiệm Box – Behnken ba yếu tố và hàm lượng CGA

thu được trong các điều kiện thuỷ phân khác nhau......................................... 47

Bảng 3.3. Kết quả phân tích phương sai mô hình tối ưu bằng phần mềm

Design Expert 10.0.3 (Bảng Anova)............................................................... 48

Bảng 3.4. Kiểm tra mô hình thí nghiệm tối ưu hoá tách chiết CGA .............. 51

Bảng 3.5. Diện tích peak CGA ở các nồng độ................................................ 52

Bảng 3.6. Kết quả xác định hàm lượng CGA bằng HPLC............................. 54

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của CGA tới sự phát triển của vi khuẩn có lợi và vi

khuẩn gây hại. ................................................................................................. 55

Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa...................................... 56

Bảng 3.9. Nhiệt độ và thời gian sấy mẫu để thu nhận chế phẩm CGA .......... 57

vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Công thức cấu trúc của chlorogenic acid....................................................3

Hình 1.2. Một số sản phẩm thực phẩm chức năng chứa chlorogenic acid...............8

Hình 1.3. Cấu tạo quả cà phê ......................................................................................10

Hình 1.4. Tác động của pectinase lên phân tử pectin ...............................................16

Hình 3.1. Quả cà phê xanh sau khi xử lý (A), sấy (B), nghiền và rây (C)..............34

Hình 3.2. Đồ thị đường chuẩn CGA ..........................................................................35

Hình 3.3. Đồ thị mối liên hệ tỷ lệ cơ chất – dung môi và hàm lượng chiết xuất

CGA...............................................................................................................................36

Hình 3.4. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu tới

quá trình chiết xuất CGA.............................................................................................36

Hình 3.5. Đồ thị mối liên hệ nồng độ enzyme tới hàm lượng chiết xuất CGA .....37

Hình 3.6. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới

quá trình chiết xuất CGA.............................................................................................38

Hình 3.7. Đồ thị mối quan hệ độ pH dung môi và hàm lượng chiết xuất CGA ...39

Hình 3.8. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của pH tới quá trình chiết

xuất CGA......................................................................................................................40

Hình 3.9. Đồ thị mối quan hệ của nhiệt độ và hàm lượng chiết xuất CGA...........41

Hình 3.10. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình

chiết CGA.....................................................................................................................42

Hình 3.11. Đồ thị mối quan hệ của tốc độ lắc và hàm lượng chiết xuất CGA......43

Hình 3.12. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của tốc độ lắc tới quá

trình chiết xuất CGA....................................................................................................43

Hình 3.13. Đồ thị mối quan hệ của thời gian thuỷ phân và hàm lượng chiết xuất

CGA...............................................................................................................................44

Hình 3.14. Sắc ký đồ CGA trong thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân

tới quá trình chiết xuất CGA.......................................................................................45

Hình 3.15. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu thuỷ phân cà phê xanh thu CGA ...50