Nghiên cứu đặc tính của Chitinase tự nhiên và biểu hiện Chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium Lecanii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

NGUYỄN HỮU QUÂN

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH CỦA CHITINASE

TỰ NHIÊN VÀ BIỂU HIỆN CHITINASE TÁI TỔ HỢP

TỪ CHỦNG NẤM LECANICILLIUM LECANII

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

T , 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

NGUYỄN HỮU QUÂN

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH CỦA CHITINASE

TỰ NHIÊN VÀ BIỂU HIỆN CHITINASE TÁI TỔ HỢP

TỪ CHỦNG NẤM LECANICILLIUM LECANII

Chuyên ngành:

Mã số: 62 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

:

PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh

T , 2015

i

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận án là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự

hướng dẫn của PGS.TS. Quyền Đình Thi, PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, sự

giúp đỡ của các cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ

Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các số liệu

luận án là trung thực, một phần kết quả đã được công bố trên

các tạp chí chuyên ngành dưới sự cho phép của các đồng tác giả, phần

còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ các công trình nào khác. M

.

Tác giả luận án

Nguyễn Hữu Quân

ii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Quyền Đình Thi đã định hướng

nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện hóa chất, thiết bị

kinh phí để tôi hoàn thành luận án này.

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh

đã chỉ bảo, sửa luận án để tôi hoàn thành luận án này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Công nghệ

sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ chia sẻ kinh

nghiệm chuyên môn cho tôi trong quá trình thực nghiệm .

Nghiên cứu sản xuất và sử dụng chế

phẩm từ nấm Lecanicillium

thôn do PGS.TS. Quyền Đình Thi và TS. Vũ Văn Hạnh làm chủ nhiệm, 2010-2013.

Tôi xin cảm ơn Khoa Khoa học Sự sống, Phòng Đào tạo Trường Đại học

Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình

.

Tôi xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Giáo dục T , Khoa Sinh

- K , Phòng Khoa học Công nghệ và Hợp tác quốc tế, Ban

Giám hiệu Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và các bạn đồng

nghiệp đã ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án.

Lời cảm ơn sau cùng tôi xin dành cho gia đình và những người thân, bạn bè

đã luôn động viên giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình làm

nghiên cứu sinh.

Tác giả luận án

Nguyễn Hữu Quân

iii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN........................................................................................ i

LỜI CẢM ƠN.............................................................................................. ii

MỤC LỤC................................................................................................... iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.......................................................... vii

DANH MỤC HÌNH..................................................................................... ix

DANH MỤC BẢNG.................................................................................... xii

MỞ ĐẦU....................................................................................... ............. 1

1. Đặt vấn đề....................................................................................... ........ 1

2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................ 2

3. Nội dung nghiên cứu................................................................................ 2

4. Những đóng góp mới của luận án............................................................ 3

.................................... 3

.............................................. ......... 5

1.1. Nấm Lecanicillium lecanii .................................................................. 5

1.2. Chitinase .............................................................................................. 5

1.2.1. Nguồn gốc của chitinase..................................................................... 6

1.2.2. Phân loại chitinase.............................................................................. 7

1.2.3. Cấu trúc và trung tâm hoạt động của chitinase................................... 9

1.2.4. Cơ chế phản ứng của chitinase........................................................... 12

1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase............................... 14

1.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp chitinase.............. 16

iv

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

1.3. Ứng dụng của nấm L. lecanii và chitinase......................................... 19

1.3.1. Trong lĩnh vực nông nghiệp và bảo vệ môi trường............................ 19

1.3.2. Trong lĩnh vực y học.......................................................................... 23

1.3.3. Trong lĩnh vực công nghệ sinh học.................................................... 24

1.4. Một số nghiên cứu về gen và biểu hiện gen mã hóa chitinase......... 25

1.4.1. Trên thế giới....................................................................................... 25

1.4.2. Ở Việt Nam......................................................................................... 29

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP.......................................... 33

2.1. Vật liệu và hóa chất............................................................................. 33

2.1.1. Chủng giống....................................................................................... 33

2.1.2. Thiết bị............................................................................................... 33

2.1.3. Hóa chất............................................................................................. 33

2.1.4. Dung dịch và đệm.............................................................................. 34

2.1.5. Môi trường nuôi cấy........................................................................... 34

2.1.6. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận án ..................................... 33

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................... 33

2.2.1. Phương pháp nuôi cấy........................................................................ 33

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu trên enzyme/protein…............................... 35

2.2.3. Các phương pháp sinh học phân tử.................................................... 42

2.2.4. Các phương pháp thử nghiệm............................................................. 47

2.2.7. Xử lý số liệu....................................................................................... 49

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN..................... 50

3.1. Sàng lọc, kiểm tra và khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase

v

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

từ nấm L. lecanii......................................................................................... 50

3.1.1. Sàng lọc chủng nấm L. lecanii sinh tổng hợp chitinase cao............... 50

3.1.2. Kiểm tra chủng nấm L. lecanii 43H dựa vào đoạn gen 28S rRNA... 50

3.1.3. Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase........................................ 53

3.2. Tinh sạch và đánh giá đặc tính lý hóa của chitinase từ chủng

nấm L. Lecanii 43H..................................................................................... 61

3.2.1. Tinh sạch chitinase............................................................................. 61

3.2.2. Đánh giá đặc tính lý hóa của chitinase từ chủng nấm L. lecanii

43H............................................................................................................... 64

3.3. Nhân dòng gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H...... 67

3.4. Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của rChit trong

nấm men P. pastoris X33............................................................................ 71

3.4.1. Thiết kế plasmid pPChit biểu hiện gen Chit trong nấm men............. 71

3.4.2. Biểu hiện chitinase tái tổ hợp trong nấm men P. pastoris................. 72

3.4.3. Tinh sạch rChit................................................................................... 77

3.4.4. Đánh giá đặc tính lý hóa của rChit từ nấm men P. pastoris X33....... 79

3.5. Thử nghiệm khả năng ức chế rệp và nấm bệnh của chitinase và

bào tử từ nấm L. lecanii............................................................................. 85

3.5.1. Ảnh hưởng của chitinase tới sự phát triển của nấm bệnh hại cây

trồng............................................................................................................. 85

3.5.2. Ảnh hưởng của rChit tới khả năng phát triển của rệp........................ 87

3.5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của sợi nấm........... 88

3.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng nẩy mầm của bào tử nấm...... 89

3.5.5. Khả năng diệt rệp của chủng nấm L. lecanii 43H.............................. 90

vi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................... 93

1. KẾT LUẬN.............................................................................................. 93

2. KIẾN NGHỊ............................................................................................. 93

... 94

TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................... 95

DANH MỤC PHỤ LỤC............................................................................. 114

vii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tiếng Anh Tiếng Việt

BLAST Basic local alignment search tool Phần mềm so sánh trình tự

bp Base pair Cặp bazơ

cDNA Complement DNA DNA bổ sung

Chit Gene encoding chitinase Gen mã hóa chitinase

CMC Cacboxyl methyl cellulose Cacboxyl methyl cellulose

DEPC Diethylpyrocarbonate Diethylpyrocarbonate

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

DNase Deoxyribonuclease Enzyme thủy phân DNA

dNTPs 2 -Deoxynucleoside 5 -

triphosphate

Các nucleotide

ĐC Control Đối chứng

IPTG Isopropyl-beta-D￾thiogalactopyranoside

Isopropyl-beta-D￾thiogalactopyranoside

EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid Axit ethylenediamine tetraacetic

EtBr Ethidium bromide Ethidium bromide

kb Kilo base Kilo base

kDa Kilo Dalton Kilo Dalton

M Marker Thang chuẩn

OD Optical density Mật độ quang

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại gen

RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic

viii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

RNase Ribonuclease Enzyme thủy phân RNA

RT-PCR Reverse transcription polymerase

chain reaction

Phản ứng khuếch đại gen

rChit Recombinante chitinase Chitinase tái tổ hợp

SDS￾PAGE

Sodium dodecyl sulfate

Polyacrylamide gel

electrophoresis

Điện di biến tính protein trên gel

polyacrylamide

Taq Thermus aquaticus Thermus aquaticus

TBE Tris boric acid EDTA Tris boric acid EDTA

TE Tris EDTA Tris EDTA

TEMED N,N,N ,N -

Tetramethylethylenediamine

N,N,N ,N -

Tetramethylethylenediamine

v/v Volume/volume Thể tích/thể tích

w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích

ix

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Cấu trúc bậc 2 của chitinase từ nấm C. immitis........................... 10

Hình 1.2. Cấu trúc của chitinase từ vi khuẩn Ralstonia sp. A-471 ............. 11

Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của chitinase B từ vi khuẩn S. mecescens........... 12

Hình 1.4. Cơ chế thủy phân β-chitin bởi chitinase A từ vi khuẩn

B. circulans................................................................................................... 13

Hình 2.1. Đường chuẩn nồng độ N-acetyl glucosamine theo phương pháp

Miller............................................................................................................ 37

Hình 2.2. Các bước tinh sạch chitinase........................................................ 38

Hình 2.3. Đường chuẩn hàm lượng albumin huyết thanh bò theo

Bradford........................................................................................................ 39

Hình 2.4. Đồ thị Lineawever-Burk.............................................................. 40

Hình 2.5. Sơ đồ mô tả vị trí gắn của gen Chit vào genome của nấm men

P. pastoris X33............................................................................................. 47

Hình 3.1. Hoạt tính chitinase của 8 chủng nấm L. lecanii........................... 50

Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng nấm

L. lecanii 43H; Sản phẩm Plasmid và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng

XhoI và XbaI...................... .......................................................................... 51

Hình 3.3. Trình tự đoạn gen 28S rRNA và cây phân loại trình tự gen 28S

rRNA từ chủng nấm L. lecanii 43H với các loài khác……………………. 52

Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng

sinh tổng hợp chitinase ................................................................................ 53

Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ chitin huyền phù và nguồn nitơ đến

khả năng sinh tổng hợp chitinase ................................................................ 55

x

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Hình 3.6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và pH nuôi cấy lên khả năng

sinh tổng hợp chitinase ................................................................................ 56

Hình 3.7. Hình ảnh điện di SDS-PAGE của chitinase tinh sạch từ chủng

nấm L. lecanii 43H và hoạt tính chitinase của các phân đoạn qua cột

DEAE-Sephadex A-50 trên đĩa thạch có bổ sung cơ chất chitin huyền phù

0,5%.............................................................................................................. 59

Hình 3.8. Nhiệt độ và pH thích hợp của chitinase ...................................... 61

Hình 3.9. Độ bền nhiệt và độ bền pH của chitinase .................................... 62

Hình 3.10. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa lên hoạt tính

chitinase ....................................................................................................... 65

Hình 3.11. Phân tích TLC các sản phẩm thủy phân chitin bởi chitinase....... 67

Hình 3.12. Kết quả nhân dòng gen Chit từ DNA hệ gen............................. 67

Hình 3.13. Trình tự gen Chit và amino acid suy diễn từ L. lecanii 43H..... 68

Hình 3.14. Cây phân loại dựa vào so sánh trình tự gen Chit của chủng

L. Lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank...................................... 69

Hình 3.15. Kết quả nhân dòng gen Chit từ mRNA...................................... 70

Hình 3.16. Cây phân loại dựa vào so sánh trình tự amino acid của rChit

từ L. Lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank.................................. 71

Hình 3.17. Kết quả thiết kế cấu trúc vector biểu hiện pPChit..................... 72

Hình 3.18. Điện di sản phẩm kiểm tra hệ biểu hiện rChit trong P. pastoris

X33............................................................................................................... 71

Hình 3.19. Khả năng sinh tổng hợp rChit của chủng tái tổ hợp khi được

cảm ứng ở các nồng độ methanol khác nhau................................................ 74

Hình 3.20. Khả năng sinh tổng hợp rChit ở các khoảng thời gian khác

nhau.............................................................................................................. 75

xi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Hình 3.21. Điện di SDS-PAGE của rChit tinh sạch từ P. pastoris X33...... 78

Hình 3.22. Nhiệt độ và pH thích hợp của rChit........................................... 80

Hình 3.23. Độ bền nhiệt và độ bền pH của rChit......................................... 81

Hình 3.24. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa lên hoạt tính

rChit ............................................................................................................. 84

Hình 3.25. Ức chế sự phát triển của nấm bệnh F. oxysporum và R. solani

bởi chitinase ................................................................................................. 87

Hình 3.26. Sợi nấm của R. solani và F. oxysporum được xử lý với nước

và với chitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H.............................................. 87

Hình 3.27. Hỗn hợp chitin của rệp được xử lý với nước và rChit từ nấm

men P. pastoris X33 ................................................................................... 88

Hình 3.28. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỉ lệ nẩy mầm của

bào tử nấm L. lecanii 43H ........................................................................... 90

Hình 3.29. Mô hình lá cải có rệp sau khi được phun dịch bào tử nấm và

biểu đồ thể hiện khả năng diệt rệp bằng bào tử của chủng nấm L. lecanii

43H ..............................................................................................................

92