Nghiên cứu đặc điểm và biểu hiện gen liên quan đến tính kháng mọt phân lập từ cây ngô

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN phâm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

VÌ THỊ XUÂN THỦY

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ BIỂU HIỆN GEN

LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG MỌT PHÂN LẬP TỪ CÂY NGÔ

LUẬN ÁN TIẾN SĨSINH HỌC

Thái Nguyên, 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

VÌ THỊ XUÂN THỦY

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ BIỂU HIỆN GEN LIÊN QUAN ĐẾN

TÍNH KHÁNG MỌT PHÂN LẬP TỪ CÂY NGÔ

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. GS.TS. Chu Hoàng Mậu

2. PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh

Thái Nguyên, 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của

GS.TS. Chu Hoàng Mậu và PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh. Các kết quả trình

bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các Tạp chí khoa

học - công nghệ, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào

khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc.

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2017

TÁC GIẢ

Vì Thị Xuân Thủy

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu, PGS.TS.

Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã trực tiếp hướng dẫn và thường xuyên chia sẻ, động

viên khích lệ để tôi có được sự tự tin và lòng đam mê khoa học giúp tôi hoàn thành

luận án này.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Chu Hoàng Hà, PGS.TS. Lê Văn Sơn,

TS. Phạm Bích Ngọc, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và

tạo mọi điều điều kiện tốt nhất để tôi tiến

hành các thínghiêṃ tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng công nghệ ADN

ứng dụng.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của thầy cô và cán bộ Bộ môn Sinh học

hiện đại & Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái

Nguyên. Được học tập và sinh hoạt chuyên môn tại tập thể khoa học nghiêm túc,

ngoài việc nhận được những đóng góp quý báu, tôi còn có cơ hội trang bị cho mình

về phương pháp nghiên cứu và những hiểu biết sâu sắc hơn về nhiều vấn đề Sinh

học hiện đại.

Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Sinh học, các thầy cô giáo và

cán bộ Bô ̣ phâṇ đào taọ Sau đại học, Trường Đaị hoc̣ Sư phaṃ - Đaị hoc̣ Thái

Nguyên đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này.

Tôi xin cảm ơn Trường Đại học Tây Bắc, đồng nghiệp của tôi là thầy cô giáo,

cán bộ Khoa Sinh - Hoá và các đơn vị chức năng đã tạo cho tôi mọi điều kiện thuận

lợi về mặt quản lý trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng tri ân đối với những người thầy, những đồng nghiệp,

gia đình và bạn bè là những điểm tựa tinh thần vững chắc, đã giúp đỡ, động viên,

khích lệ, chia sẻ những khó khăn và luôn đồng hành cùng tôi trong quá trình học tập

của mình.

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2017

TÁC GIẢ

Vì Thị Xuân Thủy

ii

DANH MUC̣ NHỮNG TỪ VÀ CHỮVIẾT TẮT

ABA Abscisic Acid

AS Acetylseringone

bp base pairs Cặp bazơ nitơ

cs Cộng sự

Ct Threshold of Cycle Chu kỳ ngưỡng

DAB 3,3'-Diaminobenzidine

tetrahydrochloride

EST Expressed Sequence Tag Trình tự đánh dấu biểu hiện

ETDA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

FAO Food and Agriculture Organization Tổ chức Nông - Lương thế giới

GFP Green Fluorescene Protein Protein huỳnh quang xanh

GM Germination Medium Môi trường nẩy mầm

Gus β-Glucuronidase

IPTG IsoPropylThio-β-Galactoside

LB Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng cơ bản

nuôi cấy vi khuẩn

MS Murashige và Skoog, 1962 Môi trường dinh dưỡng cơ bản

nuôi cấy mô thực vật

OD Optical Density Mật độ quang

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

rZmDEF1 Recombinant ZmDEF1 protein Protein tái tổ hợp ZmDEF1

RM Rooting Medium Môi trường tạo rễ

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase

Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp -

phiên mã ngược

iii

T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA được chuyển vào

thực vật

Ti-plasmid Tumor inducing - plasmid Plasmid gây khối u

TMB 3,3’,5,5’-TetraMethyl Benzidine

T0, T1 Các thế hệ cây chuyển gen

T0

Cây chuyển gen tái sinh từ chồi

trong ống nghiệm

T1

Hạt của cây chuyển gen T0 nảy

mầm thành cây T1

X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D￾galactose-pyranoside

ZmDEF1 Gen defensin1 ở ngô

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................................................1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................................5

1.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÂY NGÔ VÀ MOṬ NGÔ...................................5

1.1.1. Giá trị của cây ngô và tác hại của mọt ngô .......................................................5

1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, hóa sinh của ngô liên quan đến tính kháng mọt ngô..11

1.2. ĐĂC̣ ĐIỂM CỦA DEFENSIN THỰC VÂṬ .........................................................................16

1.2.1. Cấu trúc, chức năng của defensin thực vật.....................................................16

1.2.2. Cơ chế ức chế α-amylase của defensin thực vâṭ....................................................................21

1.2.3. Nghiên cứu defensin ở cây ngô.......................................................................25

1.3. NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở NGÔ...............................................................................27

1.3.1. Nghiên cứu chuyển gen vào phôi non ngô thông qua A. tumefaciens...............................27

1.3.2. Một số thành tựu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen ở ngô..................................30

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................39

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU.......................................................................................................39

2.1.1. Vật liệu thực vật ..............................................................................................39

2.1.2. Các chủng vi khuẩn và các loại vector............................................................40

2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ................................40

2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu ..........................................................................40

2.2.2. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................41

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................................................41

2.3.1. Phương pháp đánh giá khả năng kháng mọt ...................................................42

2.3.2. Phương pháp tách dòng và giải tự trình tự gen ZmDEF1 ...............................44

2.3.3. Phương pháp thiết kế vector chuyển vào thực vật mang gen chuyển ZmDEF1 ....47

2.3.4. Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ...........50

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.........................................................61

iv

3.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU61

3.1.1. Khối lượng hao hụt của các giống ngô nghiên cứu ........................................61

3.1.2. Tỷ lệ tạo bột của các giống ngô nghiên cứu ...................................................62

3.1.3. Tỷ lệ nhiễm mọt của các giống ngô nghiên cứu .............................................63

3.1.4. Hệ số gia tăng quần thể mọt của các giống ngô nghiên cứu...........................63

3.2. ĐẶC ĐIỂM GEN ZmDEF1 PHÂN LẬP TỪ CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU......66

3.2.1. Đặc điểm của gen ZmDEF1 (cDNA) phân lâp̣ từ các giống ngô nghiên cứu .....66

3.2.2. Đặc điểm của gen ZmDEF1 phân lập từ DNA ...............................................71

3.2.3. Sựđa dạng về trình tự vùng mã hóa gen ZmDEF1 ở ngô...............................73

3.3. BIỂU HIỆN GEN ZmDEF1 Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN .................75

3.3.1. Thiết kế cấu trúc mang gen chuyển ZmDEF1.................................................75

3.3.2. Chuyển cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào cây thuốc lá nhờ A. tumefaciens78

3.3.3. Phân tích cây thuốc lá chuyển gen......................................................................80

3.4. BIỂU HIỆN GEN ZmDEF1 Ở CÂY NGÔ CHUYỂN GEN.............................89

3.4.1. Kết quả chuyển gen gus vào phôi ngô giống LVN99..........................................................89

3.4.2. Chuyển cấu trúc mang gen ZmDEF1 vào phôi ngô nhờ A. tumefaciens........93

3.4.3. Xác định sự có mặt của gen chuyển ZmDEF1 ở thế hệ cây ngô chuyển gen T0 ...97

3.4.4. Phân tích biểu hiện protein ZmDEF1 tái tổ hợp ở thế hệ T1.........................101

3.4.5. Kiểm tra chức năng sinh học của protein ZmDEF1 tái tổ hợp ở thế hệ T1 ...102

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.............................................................................................................105

1. Kết luận ...............................................................................................................105

2. Đề nghị ................................................................................................................105

TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................................................108

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Mối tương quan giữa các thành phần hoá học với tính kháng mọt của hạt ngô.14

Bảng 1.2. Các protein được mã hóa bởi các gen từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis

được chuyển vào cây ngô..........................................................................................32

Bảng 2.1. Các giống ngô sử dụng trong nghiên cứu.................................................39

Bảng 2.2. Thống kê các trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu...............................40

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR với Master Mix.............................................45

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen ZmDEF1 vào vector tách dòng pBT .......46

Bảng 2.5. Thành phần môi trường LB lỏng và LB đặc.............................................46

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI...........47

Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt plasmid pDON201-SLHEP-HA bằng SalI và

HindIII.......................................................................................................................49

Bảng 2.8. Thành phần phản ứng trao đổi LR............................................................49

Bảng 2.9. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng HindIII......................................50

Bảng 2.10. Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá………………………… 51

Bảng 2.11. Thành phần môi trường tái sinh cây ngô chuyển gen.............................53

Bảng 2.12. Thành phần phản ứng cắt DNA tổng số bằng SalI.................................57

Bảng 2.13. Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR .............................................59

Bảng 2.14. Chu trình nhiệt độ của phản ứng Real-time RT-PCR.............................59

Bảng 3.1. Khối lượng hao hụt hạt của các giống ngô nghiên cứu sau các thời gian

gây nhiễm mọt...........................................................................................................61

Bảng 3.2. Tỷ lệ bột ngô tạo ra của các giống nghiên cứu sau các thời gian gây

nhiễm mọt..................................................................................................................62

Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm mọt của các giống ngô nghiên cứu sau các thời gian gây

nhiễm.........................................................................................................................63

v

Bảng 3.4. Hệ số gia tăng quần thể mọt của các giống ngô nghiên cứu sau các thời

gian gây nhiễm ..........................................................................................................64

Bảng 3.5. Chỉsố mẫn cảm mọt tương đối (Sn) của các giống ngô nghiên cứu........65

Bảng 3.6. Sự sai khác về trình tự nucleotide trên vùng mã hóa gen ZmDEF1 của các

giống ngô nghiên cứu................................................................................................69

Bảng 3.7. Sự sai khác về trình tự nucleotide gen ZmDEF1 phân lập từ DNA của

giống ngô địa phương SLvà giống ngô lai LVN99...................................................73

Bảng 3.8. Một số trình tự gen ZmDEF1 để phân tích đa dạng di truyền..................74

Bảng 3.9. Kết quả biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào cây thuốc lá C9-1…....78

Bảng 3.10. Kết quả phân tích chu kỳ ngưỡng và tỷ lệ biểu hiện của gen ZmDEF1 ở

các cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T1......................................................................84

Bảng 3.11. Kết quả phân tích khả năng ức chế α-amylase mọt ngô của protein

ZmDEF1 tái tổ hợp từ hạt cây thuốc lá chuyển gen T1.............................................87

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của mâṭ đô ̣A. tumefaciens, nồng đô ̣ acetosyringone (AS),

thờ

i gian nhiêm̃ khuẩn đến hiêụ quả chuyển gen gus...............................................90

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tuổi phôi đến hiêụ suất biểu hiện gen gus và tạo mô sẹo

của giống ngô LVN99...............................................................................................91

Bảng 3.14. Nồng độ kanamycin (mg/l) cho ngưỡng chọn lọc phôi ngô LVN99 mang

gen gus .....................................................................................................................92

Bảng 3.15. Kết quả tái sinh cây chuyển gen ZmDEF1 của giống ngô LC1 và LVN99. .96

Bảng 3.16. Kết quả phân tích khả năng ức chế α-amylase mọt ngô của protein tái tổ

hợp ZmDEF1 từ hạt cây ngô chuyển gen T1...........................................................103

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Hình ảnh Sitophilus zeamais Motsch. .........................................................8

Hình 1.2. Hai lớp defensin thực vật ..........................................................................16

Hình 1.3. Cấu trúc của chuỗi polypeptide defensin thực vật ....................................17

Hình 1.4. Cấu trúc không gian của defensin thực vật (VrD2) ..................................18

Hình 1.5. Mô hình mô tả sự phân bố điện tích bề mặt của α-amylase của T. molitor

(TMA), VrD1, VrD2 và vị trí gắn kết giữa TMA và VrD1......................................23

Hình 1.6. Biểu đồ biểu thị khả năng ức chế α-amylase từ các nguồn khác nhau của

defensin VuD1 ..........................................................................................................23

Hình 1.7. Mô hình mô tả cơ chế ức chế α-amylase của VuD1 .................................24

Hình 1.8. Kết quả phản ứng RT-PCR gen ZmDEF1 ở các mô khác nhau của cây ngô.....26

Hình 1.9. Mô hình phương thức hoạt động của nội độc tố Cry trong đường ruột của

côn trùng....................................................................................................................31

Hình 2.1. Hình thái hạt các giống ngô nghiên cứu ...................................................39

Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát .......................................................................42

Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen mang gen ZmDEF1 ...........................427

Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào phôi non của ngô ................................56

Hình 3.1. Đồ thị rada biểu thị khả năng kháng mọt của các giống ngô nghiên cứu

sau các ngày nhiễm mọt ............................................................................................65

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR nhân gen ZmDEF1 ………………..67

Hình 3.3. Trình tự gen ZmDEF1 của các giống ngô nghiên cứu và JF797205 trên

Ngân hàng gen Quốc tế .............................................................................................70

Hình 3.4. Trình tự amino acid suy diễn của protein ZmDEF1 ở các giống nghiên

cứu và JF797205 trên Ngân hàng gen Quốc tế .........................................................70

Hình 3.5. Trình tự gen ZmDEF1 của giống ngô địa phương SL và giống ngô lai

LVN99 phân lập từ DNA..........................................................................................72

Hình 3.6. Sơ đồ cấu trúc của gen ZmDEF1 của ngô.................................................72

vi

Hình 3.7. Sơ đồ hình cây thể hiện sự khác biệt di truyền về trình tự nucleotide đoạn

mã hoá của gen ZmDEF1..........................................................................................75

Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng HindIII………..77

Hình 3.9. Sơ đồ cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 .......................................................77

Hình 3.10. Kết quả tá

i sinh và chuyển cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào cây thuốc

lá C9-1.......................................................................................................................79

Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen ZmDEF1

trong các cây thuốc lá chuyển gen ............................................................................81

Hình 3.12. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR nhân gen ZmDEF1 của dòng

cây thuốc lá chuyển gen ............................................................................................82

Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại của các cặp mồi chuẩn bị cho phản

ứng Real-time RT-PCR trên dòng cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 .....................83

Hình 3.14. Biểu đồ mức độ biểu hiện của gen ZmDEF1 từ các dòng thuốc lá chuyển

gen thế hệ T1..............................................................................................................84

Hình 3.15. Kết quả lai Western các cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 ...................85

Hình 3.16. Hình ảnh định tính đánh giá khả năng ức chế α-amylase mọt ngô của

protein tái tổ hợp ZmDEF1 từ hạt cây thuốc lá chuyển gen T1.................................88

Hình 3.17. Hình ảnh tái sinh ngô chuyển gen ZmDEF1 từ phôi ngô non giống

LVN99 vụ hè - thu năm 2016 ...................................................................................94

Hình 3.18. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen chuyển

ZmDEF1 trong các cây ngô chuyển gen thế hệ T0....................................................98

Hình 3.19. Kết quả lai Southern các cây ngô chuyển gen ZmDEF1 ......................100

Hình 3.20. Kết quả lai Western các cây ngô chuyển gen ZmDEF1 thế hệ T1 ........102

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Ngô (Zea mays L.) là một trong những cây ngũ cốc chính có năng suất cao và

giá trị kinh tế lớn, góp phần nuôi sống hơn 30% dân số thế giới. Ngày nay, trên thế

giới cây ngô đứng thứ ba về diện tích, đứng thứ hai về sản lượng và đứng đầu về

năng suất. Ngô được dùng để sản xuất ra khoảng 650 mặt hàng khác nhau trong

các ngành công nghiệp lương thực, thực phẩm, dược phẩm9 và công nghiệp nhẹ.

Ngô góp phần vào việc ổn định sản lượng ngũ cốc trên thế giới và có vai trò quan

trọng trong kinh tế và thương mại quốc tế. Ở Việt Nam, việc phát triển cây ngô

trong thời gian qua đã đạt được nhiều thành tựu, tăng nhanh cả về diện tích, năng

suất và sản lượng; tuy nhiên cũng gặp nhiều thách thức, trong đó có vấn đề sâu

hại. Đã có nhiều giống ngô lai mới có năng suất cao được đưa vào sản xuất, song

xuất hiện những hạn chế về khả năng bảo quản, như dễ bị nấm, mọt… xâm hại

trong khi nhiều giống ngô địa phương truyền thống tuy năng suất thấp nhưng khả

năng bảo quản sau thu hoạch lại tốt hơn.

Mọt ngô (Sitophilus zeamais Motsch.) là loại đa thực, chúng có thể ăn được

hầu hết các loại ngũ cốc, các loại đậu, hạt có dầu và nhiều sản phẩm thực vật khác.

Thức ăn thích hợp nhất với mọt ngô là hạt ngô. Năng suất và chất lượng ngô bị

ảnh hưởng nhiều bởi mọt ngô, chúng làm giảm sản lượng sau thu hoạch trung bình

là 20%, có những trường hợp sự phá hại của chúng lên đến 90% trong vòng sáu

tháng. Ngăn chặn sự tấn công của mọt với ngô hiện nay đang là vấn đề cấp bách

trong bảo quản ngô góp phần bảo đảm an ninh lương thực trên toàn thế giới. Một

số biện pháp bảo quản ngô sau thu hoạch hiện nay được sử dụng phổ biến là sấy ở

nhiệt độ cao để tiêu diệt ấu trùng mọt, vần đảo, trộn bụi trơ, dùng thảo mộc,… Tuy

vậy, các biện pháp này tốn nhiều công sức, hiệu quả thấp, giá thành cao. Mặt khác,

biện pháp dùng thuốc hoá học thì gây ra nhiều mối lo ngại về ô nhiễm môi trường,

độc hại tới vật nuôi và con người.

Defensin thực vật phân bố rộng rãi trong giới thực vật, có cấu trúc không

gian nhỏ, bền, hình cầu với thành phần cơ bản khoảng 45 - 54 amino acid giàu

cysteine. Defensin là protein đa chức năng, chúng ức chế quá trình dịch mã, ảnh

hưởng đến chức năng của kênh màng, làm suy yếu vi sinh vật, tăng cường khả