Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tạo sinh khối giàu astaxanthin của loài vi tảo lục Haematococcus pluvialis Flotow nhằm ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LƯU THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TẠO

SINH KHỐI GIÀU ASTAXANTHIN CỦA LOÀI

VI TẢO LỤC Haematococcus pluvialis FLOTOW

NHẰM ỨNG DỤNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY

SẢN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2017

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LƯU THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TẠO SINH

KHỐI GIÀU ASTAXANTHIN CỦA LOÀI

VI TẢO LỤC Haematococcus pluvialis FLOTOW

NHẰM ỨNG DỤNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY

SẢN

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 62 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đặng Diễm Hồng

Viện Công nghệ sinh học

HÀ NỘI - 2017

i

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:

PGS. TS. Đặng Diễm Hồng, nguyên Trưởng phòng Công nghệ Tảo, Viện Công

nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - người thầy đã định

hướng, chỉ bảo những kiến thức khoa học, tận tâm giúp đỡ và động viên tôi vượt qua

những trở ngại và khó khăn trong suốt thời gian thực hiện luận án.

Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ

gen, bộ phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học (ThS. Bùi Thị Hải Hà – phụ trách đào tạo),

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật

chất và giúp tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu.

Sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của các cô chú, anh chị, các bạn đồng nghiệp đã và

đang làm việc tại phòng Công nghệ Tảo: TS. Ngô Thị Hoài Thu, TS. Hoàng Thị Lan

Anh, TS. Hoàng Thị Minh Hiền, ThS. Lê Thị Thơm, ThS. Nguyễn Cẩm Hà, ThS. Đinh

Đức Hoàng, ThS. Bùi Đình Lãm, ThS. Đinh Thị Ngọc Mai, ThS. Nguyễn Thị Thu Thủy,

KTV. Đỗ Thị Là. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó.

Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài cấp Bộ Nông nghiệp và Phát triển

nông thôn “Nghiên cứu công nghệ nuôi vi tảo Haematococcus pluvialis và công nghệ chiết

xuất astaxanthin” 2010 – 2013 thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học

trong lĩnh vực thủy sản do ThS. Ngô Thị Hoài Thu làm chủ nhiệm và đề tài cán bộ trẻ cấp

Viện Công nghệ sinh học “Tách dòng gen mã hóa cho tổng hợp astaxanthin - carotenoid

hydroxylase (CHY) từ vi tảo lục Haematococcus pluvialis giàu astaxanthin” của năm 2016

do tôi làm chủ nhiệm. Xin cảm ơn Ông Vũ Văn Cảnh - Công ty Cổ phẩn Thủy điện Chu Va,

huyện Tam Đường, tỉnh Lai Châu đã giúp đỡ luận án thực hiện thí nghiệm trên cá hồi nuôi

tại Công ty. Tôi xin chân thành cám ơn ThS. Võ Văn Bình - Viện Nuôi trồng thủy sản 1 đã

giúp đỡ thực hiện các thí nghiệm trên cá Koi Nhật.

Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp - những người đã luôn bên

cạnh, khuyến khích và ủng hộ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả

Lưu Thị Tâm

ii

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với

các cộng sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã

được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép

của các đồng tác giả;

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm./.

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả

Lưu Thị Tâm

iii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……………………………………………………………. 1

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………... 4

1.1 Giới thiệu chung về astaxanthin…………………………………... 5

1.1.1 Đặc điểm chung……………………………………………………... 5

1.1.2 Cấu trúc của astaxanthin…………………………………………….. 6

1.1.3 Sinh tổng hợp astaxanthin…………………………………………... 6

1.1.4 Các nguồn cung cấp astaxanthin…………………………………….. 7

1.1.5 Sinh hóa học của astaxanthin………………………………………... 12

1.1.6 Đặc tính chống ôxy hóa của astaxanthin……………………………. 12

1.1.7 Ứng dụng của astaxanthin…………………………………………... 13

1.2 Giới thiệu chung về chi vi tảo lục Haematococcus……………….. 16

1.2.1 Vị trí phân loại và phân bố………………………………………….. 16

1.2.2 Các loài Haematococcus………………………………………………….. 16

1.2.3 Đặc điểm sinh học và đặc điểm hình thái…………………………… 17

1.2.4 Thành phần sinh hóa học của tảo H. pluvialis…………………………. 19

1.2.5 Quy trình sản xuất astaxanthin ở H. pluvialis…………………………. 21

1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất astaxanthin từ H. pluvialis 21

1.3 Tình hình nghiên cứu và công nghệ nuôi trồng tảo H. pluvialis cho

sản xuất astaxanthin…………………………………………………. 22

1.3.1 Nuôi cấy quang tự dưỡng…………………………………………… 23

1.3.2 Nuôi cấy dị dưỡng và tạp dưỡng……………………………………. 28

1.3.3 Nâng cao hiệu quả sản xuất astaxanthin từ H. pluvialis………………. 30

1.4 Thách thức sản xuất astaxanthin thƣơng mại từ tảo H. pluvialis 35

1.5 Ứng dụng sinh khối tảo H. pluvialis trong nuôi trồng thủy sản… 36

1.6 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo H. pluvialis ở Việt Nam 38

CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.1 Vật liệu……………………………………………………………… 40

2.1.1 Vật liệu……………………………………………………………… 40

2.1.2 Các bộ kít sinh phẩm………………………………………………... 40

iv

2.1.3 Động vật thí nghiệm………………………………………………… 40

2.1.4 Hóa chất…………………………………………………………….. 40

2.1.5 Máy móc và thiết bị………………………………………………... 41

2.1.6 Môi trường nuôi cấy……………………………………………….. 42

2.1.7 Địa điểm nghiên cứu……………………………………………….. 42

2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu………………………………………….. 42

2.2.1 Các phương pháp liên quan đến sàng lọc, định tên khoa học của

chủng vi tảo lục Haematococcus sp. HB.…………………………… 42

2.2.2 Các phương pháp liên quan đến sinh trưởng, đặc điểm sinh học của

chủng vi tảo lục Haematococcus sp. HB……………………………. 45

2.2.3 Các phương pháp liên quan đến sử dụng sinh khối chủng HB giàu

astaxanthin cho cá hồi Vân và cá Koi Nhật…………………………. 48

2.3 Bố trí thí nghiệm…………………………………………………… 49

2.3.1 Nghiên cứu sự thay đổi hình thái, kích thước của tế bào trong vòng đời

của chủng Haematococcus pluvialis HB ở cấp độ bình tam giác 250 –

1000 mL và bình nhựa 1,5 và 10 L……………………………….…… 49

2.3.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh trưởng của chủng

Haematococcus pluvialis HB trong điều kiện phòng thí

nghiệm…………………………………………………………………. 50

2.3.3 Nghiên cứu điều kiện nuôi thích hợp cho sinh trưởng của tảo

Haematococcus pluvialis HB đạt MĐTB cao................................. 51

2.3.4 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu cho tích lũy astaxanthin ở tảo

Haematococcus pluvialis HB trong pha 2........................................... 53

2.3.5 Thu hoạch sinh khối tảo……………………………………………... 55

2.3.6 Sử dụng sinh khối chủng vi tảo lục Haematococcus pluvialis HB

làm thức ăn cho cá Koi Nhật và cá hồi Vân……………………… 56

2.4 Xử lý số liệu………………………………………………………… 57

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………….. 58

3.1 Sàng lọc và đặc điểm sinh học của chủng vi tảo tiềm năng cho

sản xuất astaxanthin…………………………………...................... 58

v

3.1.1 Sàng lọc chủng vi tảo tiềm năng cho sản xuất astaxanthin……… 58

3.1.2 Định tên khoa học ở mức độ phân tử dựa vào đọc và so sánh

trình tự gen 18S rRNA…………………………………………….. 60

3.1.3 Tách dòng và phân tích trình tự gen mã hóa cho enzyme

carotenoid hydroxylase (CHY)…………………………………… 64

3.1.4 Sự thay đổi hình thái và kích thƣớc tế bào trong vòng đời của H.

pluvialis HB……………………………………………………... 67

3.2 Nuôi trồng vi tảo lục H. pluvialis HB giàu astaxanthin trong các hệ

thống khác nhau…………………………………………………... 75

3.2.1 Nuôi cấy vi tảo lục H. pluvialis HB trong pha 1...................................... 75

3.2.2 Điều kiện tối ưu cho tích lũy astaxanthin của chủng HB trong pha 2 91

3.3 Thử nghiệm bổ sung sinh khối tảo H. pluvialis HB giàu

astaxanthin cho cá Koi Nhật và cá hồi Vân……………………… 107

3.3.1 Đánh giá chất lượng sinh khối tảo H. pluvialis HB…………………. 107

3.3.2 Thử nghiệm thức ăn có phối trộn astaxanthin từ sinh khối tảo H.

pluvialis HB lên màu sắc của cá Koi Nhật và cá hồi Vân…………... 108

CHƢƠNG IV. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………... 117

4.1 Đặc điểm sinh học của chủng Haematococcus sp. HB lựa chọn

đƣợc…………………………………………………………… 117

4.2 Nuôi trồng vi tảo lục H. pluvialis HB giàu astaxanthin trong các hệ

thống khác nhau.............................................................................................. 120

4.3 Sử dụng sinh khối tảo H. pluvialis HB giàu astaxanthin trong

nuôi trồng thủy sản……………………………………………….. 129

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………... 132

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ 134

TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH……………………... 135

TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………..... 140

PHỤ LỤC……………………………………………………………

vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết

tắt

Tên đầy đủ Tên Tiếng Việt

AAPH 2,2'-Azobis (2-amidinopropane)

dihydrochloride

2,2'-Azobis (2-amidinopropane)

dihydrochloride

ACC 1-aminocyclopropane-1-cacboxylic acid Axit 1-aminocyclopropane-1-

cacboxylic

APXs Ascorbate peroxidase Ascorbate peroxidase

ARA Arachidonic acid Axít arachidonic

BHA Hydroxyanisole butylated Hydroxyanisole butylated

BKT β - carotene oxygenase β - carotene oxygenase

CHY β -carotene hydroxylase β -carotene hydroxylase

C/N Carbon/nitrogen Các bon/nitơ

DHA Docohexanenoic acid Axít docohexanenoic

DNA Deoxyribonucleic acid Axít deoxyribonucleic

DPA Docosanpentaenoic acid Axít docosanpentaenoic

E. coli Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli

EMS Etyl methanesulphonate Etyl methanesulphonate

EPA Eicosapentaenoic acid Axít eicosapentaenoic

EPR 2, 4-epibrassinolide 2, 4-epibrassinolide

GA3 Gibberellic acid Axít gibberellic

HB Hòa Bình Hòa Bình

HTNK Hệ thống nuôi kín Hệ thống nuôi kín

HTNH Hệ thống nuôi hở Hệ thống nuôi hở

JA Jasmonic acid Axít jasmonic

LB Lauria Betani Môi trường LB

MB Methylene Blue Xanh methylene

MĐTB Mật độ tế bào Mật độ tế bào

vii

MJ Methyl jasmonate Methyl jasmonate

MNNG Methylnitronitrosoguanidine Methylnitronitrosoguanidine

MV Methyl viologen Methyl viologen

NTTS Nuôi trồng thủy sản Nuôi trồng thủy sản

ORAC Oxygen radical absorbance capacity Chỉ số đánh giá khả năng

chống ôxy hóa của một chất

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

ROS Reactive oxygen species phân tử ô xy có hoạt tính

rRNA Ribosomal ribonucleic acid ARN riboxom

SOD Superoxide dismutase Super oxide dismutase

SEM Scanning electron microscope Kính hiển vi điện tử quét

SKK Sinh khối khô Sinh khối khô

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng

TB Tế bào Tế bào

viii

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Nguồn cung cấp astaxanthin khác nhau……………………….. 10

Bảng 1.2 So sánh hiệu quả của các phương pháp sản xuất astaxanthin khác

nhau……………………………………………………………… 11

Bảng 1.3 Thành phần dinh dưỡng của tảo H. pluvialis ở 2 giai đoạn sinh

trưởng khác nhau………………………………………………... 20

Bảng 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy astaxanthin ở

vi tảo lục H. pluvialis…………………………………………………. 22

Bảng 1.5 So sánh một số thông số ở các kiểu nuôi trồng tảo khác nhau….. 23

Bảng 1.6 Nuôi trồng vi tảo lục H. pluvialis trong các hệ thống nuôi khác

nhau……………………………………………………………... 29

Bảng 3.1 Bảng thống kê tỷ lệ phần trăm tương đồng (ma trận tam giác

trên) và khoảng cách di truyền (ma trận tam giác dưới) của đoạn

gen 18S rRNA giữa các loài thuộc chi Haematococcus………….. 63

Bảng 3.2 Bảng hệ số tương đồng về trình tự nucleotide giữa gen chy của

loài H. pluvialis HB và các loài Haematococus trên ngân hàng

gen Quốc tế……………………………………………………… 66

Bảng 3.3 Tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a của vi tảo H. pluvialis HB ở các

giai đoạn sinh trưởng khác nhau…………………………............ 70

Bảng 3.4 Bảng so sánh thông số sinh trưởng của tảo H. pluvialis HB trong

các môi trường nuôi và các cấp độ nuôi khác nhau……............... 77

Bảng 3.5 Sự thay đổi pH và nhiệt độ ở các hệ thống bể hở và kín………. 85

Bảng 3.6 Sinh trưởng của chủng HB ở HTNK 26 L…………………….. 87

Bảng 3.7 Sinh trưởng của chủng HB trong các HTNK 50 và 100 L……. 90

Bảng 3.8 Thành phần dinh dưỡng, kim loại nặng, vi sinh vật tổng số và

hàm lượng astaxanthin của sinh khối tảo H. pluvialis HB nuôi

trồng được dùng để phối trộn với thức ăn nuôi cá hồi Vân …… 107

Bảng 3.9 Đánh giá của 7 người có lứa tuổi và giới tính khác nhau về màu

sắc của cá ở các giai thí nghiệm và giai đối chứng……………… 109

Bảng 3.10 Sinh trưởng của cá hồi Vân ở các lô đối chứng và thí nghiệm khác nhau 111

Bảng 3.11 Thành phần dinh dưỡng, hàm lượng kim loại nặng của thịt cá

hồi Vân ở các lô thức ăn khác nhau……………………………. 114

Bảng 3.12 Hàm lượng lipít và thành phần axít béo của thịt cá hồi Vân ở các

lô thí nghiệm và đối chứng……………………………………… 115

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc của astaxanthin……………………………………. 6

Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp astaxanthin ở H. pluvialis………... 7

Hình 1.3 Phản ứng tổng hợp astaxanthin……………………………... 8

Hình 1.4 Vị trí hoạt động của astaxanthin trên màng tế bào…………. 12

Hình 1.5 Hình thái tế bào tảo H. pluvialis…………………………………. 17

Hình 1.6 Sự thay đổi hình thái tế bào (A) và sự phân bào (B) trong

vòng đời của tảo H. pluvialis…………………………………… 18

Hình 1.7 Nuôi tảo H. pluvialis trong bể hở…………………………… 24

Hình 1.8 Các dạng HTNK nuôi tảo H. pluvialis………………………… 25

Hình 1.9 Phương pháp nuôi tảo H. pluvialis theo kiểu “Perfusion”…. 27

Hình 1.10 Mô hình nuôi cấy tảo H. pluvialis theo phương pháp nuôi

gắn màng - Attached cultivation……………………………. 31

Hình 2.1 Thanh màu sắc để so sánh màu sắc của cá ở các thí nghiệm

khác nhau…………………………………………………… 49

Hình 3.1 Thay đổi MĐTB của 9 chủng Haematococcus sp. sàng lọc

trong môi trường RM lỏng………………………………….. 59

Hình 3.2 Sàng lọc các chủng vi tảo Haematococcus sp. tiềm năng

trên môi trường thạch đĩa có chiếu ánh sáng cao…………… 59

Hình 3.3 Ảnh hình thái tế bào ở các giai đoạn sinh trưởng của chủng

HB chụp dưới kính hiển vi quang học (hàng trên) và điện tử

quét (SEM) (hàng dưới)……………………………………. 60

Hình 3.4 Lưu giữ thành công vi tảo lục Haematococcus sp. HB trên

môi trường C thạch và trong môi trường RM và C lỏng 60

Hình 3.5 Kết quả tách chiết ADN tổng số (A) và sản phẩm PCR nhân

một phần gen 18S rRNA (B) của mẫu HB…………………. 61

Hình 3.6 Sản phẩm PCR tinh sạch 1 phần gen 18S rRNA (A); PCR- 62

x

checking các dòng tế bào mang vectơ tái tổ hợp có một phần

gen 18S rRNA (B) và tinh sạch DNA plasmid chứa vector

tái tổ hợp (C) của mẫu vi tảo Haematococcus sp. HB………

Hình 3.7 Cây phát sinh chủng loại của mẫu Haematococcus sp. HB… 63

Hình 3.8 Tách dòng gen chy của loài H. pluvialis HB........................ 65

Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại của gen CHY từ vi tảo H. pluvialis

HB với một số gen CHY của các loài thuộc chi

Haematococcus đã được công bố trên ngân hàng GenBank 66

Hình 3.10 Thay đổi MĐTB trong vòng đời của chủng HB nuôi ở các

thể tích khác nhau (250, 500, 1000 mL; 1,5 và 10 L)...... 71

Hình 3.11 Sự thay đổi của hàm lượng chlorophyll a, astaxanthin và

protein nội bào của chủng HB nuôi ở các cấp độ khác nhau

trong môi trường RM (250, 500, 1000 mL; 1,5 và 10 L)....... 72

Hình 3.12 Ảnh chạy TLC dạng sắc tố của tế bào H. pluvialis HB ở các

giai đoạn sinh trưởng khác nhau …………………………… 73

Hình 3.13 Sự thay đổi hình thái và kích thước tế bào trong vòng đời

của chủng HB quan sát dưới kính hiển vi quang học………. 74

Hình 3.14 Sự thay đổi của MĐTB của chủng HB ở nhiệt độ (A) và

cường độ ánh sáng (B) khác nhau…………………………... 79

Hình 3.15 Sự thay đổi của MĐTB của chủng HB ở pH (A) và nguồn

nitơ (B) khác nhau…………………………………………... 79

Hình 3.16 Thay đổi MĐTB tảo H. pluvialis HB ở các nồng độ NO3

-

trong bình tam giác 250 mL………………………………… 81

Hình 3.17 Thay đổi MĐTB (A) và hàm lượng astaxanthin (B) của

chủng HB khi được nuôi cấy ở các chế độ chiếu sáng khác

nhau…………………………………………………………. 82

Hình 3.18 Ảnh minh họa hình thái tế bào chủng HB ở chế độ chiếu

sáng khác nhau kết hợp với nồng độ nitrate cao……………. 83

Hình 3.19 Thay đổi MĐTB của chủng HB khi nuôi cấy trong môi

trường RM-4X có chiếu ánh sáng cao và UV, chu kì sáng: 84

xi

tối là 16:8 giờ kết hợp với kỹ thuật làm mới môi trường

nuôi………………………………………………………….

Hình 3.20 Đồ thị tối ưu sinh trưởng của chủng HB trong HTNK 26 L... 87

Hình 3.21 Hình thái tế bào của chủng HB trong HTNK 26 L chụp dưới

kính hiển vi quang học (A, x 400 lần) và huỳnh quang sau

khi nhuộm Nile Red (B, x 12000 lần)………………………. 89

Hình 3.22 Hình thái tế bào chủng HB dưới kính hiển vi quang học (A)

và nhuộm bằng Nile Red (B) ở HTNK 100 L………………. 90

Hình 3.23 Sự thay đổi MĐTB (A) và hàm lượng chlorophyll a (B) của

chủng HB trong thí nghiệm nuôi cấy 2 pha (pha 2 - thiếu hụt

nitơ)…………………………………………………………. 92

Hình 3.24 Sự thay đổi hàm lượng astaxanthin (A) và protein (B) của

chủng HB trong thí nghiệm nuôi cấy 2 pha (pha 2 - thiếu hụt

nitơ)…………………………………………………………. 92

Hình 3.25 Ảnh bình thí nghiệm ở pha thiếu hụt nitơ (đối chứng và thí

nghiệm) và ở giai đoạn nảy mầm của chủng HB…………… 93

Hình 3.26 Một số ảnh hình thái tế bào của chủng HB ở thí nghiệm nuôi

cấy 2 pha (pha 2 - thiếu hụt nitơ)…………………………… 93

Hình 3.27 Sự thay đổi MĐTB (A) và hàm lượng chlorophyll a (B) của

H. pluvialis HB ở thí nghiệm nuôi cấy 2 pha (pha 2 - chiếu

ánh sáng cao)………………………………………………... 94

Hình 3.28 Sự thay đổi hàm lượng astaxanthin (A) và protein (B) của

chủng HB ở thí nghiệm nuôi cấy 2 pha (pha 2- chiếu ánh

sáng cao)……………………………………………………. 94

Hình 3.29 Một số ảnh hình thái tế bào chủng HB ở các giai đoạn trong

quá trình nuôi cấy 2 pha (pha 2 - chiếu ánh sáng cao)…… 95

Hình 3.30 Sự thay đổi MĐTB (A) và tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a

(B) chủng HB ở các nồng độ muối khác nhau……………… 96

Hình 3.31 Ảnh minh họa hình thái tế bào của chủng HB ở nồng độ

NaCl khác nhau sau 35 ngày nuôi ở cấp độ bình tam giác 97

xii

500 mL được chụp bằng kính hiển vi quang học (độ phóng

đại ảnh 2000 X)……………………………………………...

Hình 3.32 Sự thay đổi hàm lượng chlorophyll (A) và astaxanthin (B)

của chủng HB trong thí nghiệm nuôi cấy 2 pha với pha 2

sốc muối NaCl 0,8, 1,5 và 2,5%.............................................. 98

Hình 3.33 Sự thay đổi hàm lượng chlorophyll (A) và astaxanthin (B)

của chủng HB trong thí nghiệm nuôi cấy 2 pha với pha 2

sốc muối NaCl 0,8, 1,5 và 2,5%.............................................. 98

Hình 3.34 Sự thay đổi hàm lượng lipit tổng số của chủng HB ở nồng

độ sốc muối khác nhau……………………………………… 99

Hình 3.35 Hình thái tế bào chủng HB chụp dưới kính hiển vi quang học

(A) và huỳnh quang sau khi nhuộm Nile Red (B) (x 1000 lần)

ở công thức đối chứng, công thức 1,5 và 2,5% NaCl trong

bình tam giác 250 mL. Thanh thước kích thước 10 µm………

100

Hình 3.36 Sự thay đổi MĐTB của chủng HB ở các tỷ lệ C/N khác

nhau…………………………………………………………. 101

Hình 3.37 Thay đổi hàm lượng astaxanthin (A) và tỷ lệ astaxanthin/

chlorophyll a (B) của chủng HB ở các tỷ lệ C/N khác

nhau………………………………………………………… 102

Hình 3.38 Thay đổi MĐTB (A) và hàm lượng astaxanthin (B) của

chủng HB ở các nồng độ bicarbonate khác nhau…………… 103

Hình 3.39 Hình thái tế bào của chủng HB ở pha 2 được cảm ứng tích lũy

astaxanthin ở các nồng độ bicarbonate khác nhau. Thanh

thước có kích thước 10 µm…………………………………. 104

Hình 3.40 Bình nuôi và tế bào chủng HB chuyển màu đỏ ở pha 2 - cảm

ứng tích lũy astaxanthin ở nồng độ 100 mM HC03

-

……….. 104

Hình 3.41 Ảnh minh họa bình nuôi tảo H. pluvialis HB ở pha 2 - cảm

ứng tích lũy astaxanthin bằng nồng độ bicarbonate khác

nhau………………………………………………………… 104

Hình 4.42 Ảnh minh họa bước lắng trọng lực của sinh khối chủng HB 106

xiii

Hình 3.43 Hiệu quả lắng tương đối của sinh khối chủng HB………… 106

Hình 3.44 Sắc ký đồ astaxanthin chuẩn 50 ppm (A) và astaxanthin

được tách từ tảo H. pluvialis HB (B)……………………….. 107

Hình 3.45 Cá Koi thí nghiệm (trên) và cá ĐC (dưới) có màu sắc khác

nhau…………………………………………………………. 110

Hình 3.46 So sánh màu sắc của cá Koi ở các giai thí nghiệm khác nhau

(Đối chứng (A); Thí nghiệm bổ sung astaxanthin: (B) 100

mg/kg thức ăn, (C) 150 mg/kg thức ăn và (D) 200 mg/kg

thức ăn………………………………………………………. 110

Hình 3.47 Tăng trưởng khối lượng và chiều dài cá Koi của các giai thí

nghiệm khác nhau theo thời gian…………………………… 111

Hình 3.48 Ảnh chụp minh họa kích thước của cá hồi Vân ở các lô đối

chứng (ăn cám Pháp), lô thí nghiệm ăn cám Việt Nam và ăn

cám Việt Nam có bổ sung thêm 61 mg astaxanthin từ sinh

khối vi tảo H. pluvialis HB/ 1kg thức ăn…………………… 113

Hình 3.49 Ảnh minh họa về màu sắc thịt cá hồi ở 3 công thức được

nuôi bằng thức ăn khác nhau……………………………….. 113