Nghiên cứu đặc điểm phân bố và trồng thứ nghiệm nấm linh chi lim xanh (garnodema lucidum) trên môi trường nhân tạo tại tỉnh quảng nam và thành phố đà nẵng.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

-----o0o-----

ĐỖ THỊ PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM PHÂN BỔ VÀ

TRỒNG THỬ NGHIỆM NẤM LINH CHI LIM

XANH (GANODERMA LUCIDUM) TRÊN MÔI

TRƯỜNG NHÂN TẠO TẠI TỈNH QUẢNG NAM

VÀ THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

Chuyên ngành: Sinh thái học

Mã số : 60.42.60

TÓM TẮT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Đà Nẵng - Năm 2014

Công trình được hoàn thành tại

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

Người hướng dẫn khoa học : TS. ĐỖ THU HÀ

Phản biện 1 : TS. Đặng Đức Long

Phản biện 2 : TS. Vũ Thị Bích Hậu

Luận văn đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn

tốt nghiệp thạc sĩ Khoa học họp tại Đại học Đà Nẵng vào

ngày 04 tháng 01 năm 2014.

Có thể tìm hiểu luận văn tại :

- Trung tâm Thông tin-Học liệu, Đại học Đà Nẵng

- Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng

1

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Trong tự nhiên có rất nhiều loài nấm linh chi, trong đó, nấm

linh chi lim xanh có tên khoa học là Garnoderma lucidum, là dòng

linh chi đặc hữu, thuộc họ nấm lim – Ganodermataceae, mọc trên

cây lim xanh trong rừng nguyên sinh và vùng núi suối bùn tại xã Tiên

Lãnh (Tiên Phước, Quảng Nam). Do điều kiện thổ nhưỡng và khí hậu

nên hàm lượng polysacharit và acid gnodermic trong nấm lim xanh

tại đây cao hơn nấm lim xanh các khu vực khác rất nhiều, chính vì

vậy người ta thường dùng nấm lim xanh Quảng Nam để trị bệnh.

Kết quả thực nghiệm lâm sàng của bác sĩ Kerry Martain và

các cộng sự (2011) cho biết nấm linh chi lim xanh Tiên Phước giúp

kìm chế đáng kể sự tiến triển của bệnh ung thư. Đối với ung thư giai

đoạn đầu, nấm linh chi lim xanh được dùng để hỗ trợ, kết hợp với

quá trình trị liệu của tây y trong việc chữa trị các bệnh ung thư đa thể

như: ung thư gan, ung thư phổi, ung thư vú, ung thư cổ tử

cung...vv… Đối với ung thư giai đoạn cuối, nấm linh chi lim xanh

giúp ổn định và nâng cao thể trạng bệnh nhân để kéo dài sự sống.

Do những giá trị về mặt dược liệu lớn nên giá bán nấm linh

chi lim xanh rất cao, giá bán tại thời điểm cuối năm 2012 là 3 triệu

Vnđ/1kg quả thể khô đóng gói. Hiện nay việc người bệnh khắp nơi

tìm mua nấm linh chi lim xanh về dùng, đã khiến cho loài nấm quý

hiếm này đang dần trở nên khan hiếm. Người bệnh khó tìm được nấm

có chất lượng tốt, bởi đa số nấm lim xanh bán trên thị trường hàm

lượng dược chất khá thấp. Nếu tình trạng khai thác kéo dài sẽ làm

cho loài nấm linh chi lim xanh trong tự nhiên cạn kiệt, không bảo tồn

được loài cây quý này trong tương lai gần.

2

Tỉnh Quảng Nam và thành phố Đà Nẵng là những vùng có

sự chênh lệch nhiệt độ giữa tháng lạnh và tháng nóng không nhiều

lắm, nên có thể trồng loại nấm này quanh năm. Bên cạnh đó, điều

kiện độ ẩm cao cũng thuận lợi cho nấm phát triển.

Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài:

“Nghiên cứu đặc điểm phân bố và trồng thử nghiệm nấm linh chi

lim xanh (Garnodema lucidum) trên môi trường nhân tạo tại tỉnh

Quảng Nam và thành phố Đà Nẵng”

2. Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu đặc điểm phân bố, sự bảo tồn giống và trồng thử

nghiệm nấm linh chi lim xanh (Ganoderma lucidum) trên môi trường

nhân tạo trong điều kiện sinh thái tại tỉnh Quảng Nam và thành phố

Đà Nẵng.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1. Đối tượng nghiên cứu

- Nấm linh chi lim xanh (Ganoderma lucidum) tại tiểu khu

556 - xã Tiên Lãnh - Tiên Phước - Quảng Nam

3.2. Phạm vi nghiên cứu

Trong điều kiện và thời gian nghiên cứu, để hoàn thành luận

văn, chúng tôi giới hạn chỉ nghiên cứu trong phạm vi sau:

- Thời gian nghiên cứu: tháng 2/2012 – 8/2013

- Địa điểm nghiên cứu:

+ Địa điểm nơi lấy mẫu: Xã Tiên Lãnh, huyện Tiên Phước,

tỉnh Quảng Nam.

+ Địa điểm tiến hành thí nghiệm: Phòng thí nghiệm vi sinh

của khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư Phạm Đà Nẵng.

+ Địa điểm trồng nấm: Tổ 14, phường Hòa Khánh Nam,

quận Liên Chiểu, TP Đà Nẵng và Thôn 1 – xã Tiên Lãnh –Tiên

3

Phước – Quảng Nam.

- Nội dung nghiên cứu:

+ Phân lập và nghiên cứu sự phân bố của nấm linh chi lim

xanh (Garnoderma Lucidum) theo độ cao và theo thời gian (tháng).

+ Nghiên cứu lựa chọn môi trường giữ giống, nhân giống cấp

1, cấp 2 và loại giá thể phù hợp cho việc nuôi trồng tại tỉnh Quảng

Nam, Tp. Đà Nẵng.

+ Tiến hành trồng thử nghiệm nấm linh chi lim xanh trong

điều kiện sinh thái tại tỉnh Quảng Nam, thành phố Đà Nẵng.

+ Sơ bộ nghiên cứu một số dược chất có trong sản phẩm nấm

linh chi lim xanh trồng thử nghiệm tại tỉnh Quảng Nam, thành phố

Đà Nẵng.

4. Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp phỏng vấn, khảo sát thực địa và ô tiêu chuẩn

- Phương pháp xác định độ ẩm cơ chất

- Phương pháp phân lập giống từ quả thể nấm

- Phương pháp quan sát hệ sợi nấm và bào tử nấm

- Phương pháp nhân giống cấp I, cấp II, cấp III

- Phương pháp thanh trùng

- Phương pháp nuôi sợi và bảo quản giống nấm

- Phương pháp xác định dược chất có trong nấm linh chi lim xanh

- Phương pháp xử lí số liệu

5. Cấu trúc của luận văn

Luận văn có 86 trang gồm các phần sau: mở đầu, 3 chương,

kết luận và kiến nghị, tài liệu tham khảo và phụ lục

4

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. KHÁT QUÁT VỀ NẤM [3]

Nấm khác với những thực vật xanh: không có lục lạp, không

có sự phân hóa thành rễ, thân, lá, không có hoa, phần lớn không

chứa xelluloza trong thành tế bào, không có một chu trình phát

triển chung như thực vật.

1.2. GIỚI THIỆU VỀ NẤM LINH CHI [3], [2], [15]

Linh chi có rất nhiều tên gọi: nấm vạn năm, nấm thần tiên, cỏ

trường sinh, hạnh nhĩ,… trong đó linh chi thảo là phổ biến nhất và

được truyền tụng từ hàng ngàn năm với rất nhiều truyền thuyết. Theo

các sách kim điển thì linh chi có tác dụng làm trẻ hoá, sống lâu và

ngừa được bách bệnh [16].

1.2.1. Đặc điểm sinh học [15 ]

+ Cuống nấm hình trụ ít phân nhánh.

+ Lớp vỏ cuống láng đỏ, nâu đỏ, nâu đen, bong, không có

lông, phủ suốt lên bề mặt tán nấm.

+ Bào tử đảm thường được mô tả dạng trứng cụt (truncate).

1.2.2. Đặc điểm sinh trưởng và sinh sản [16]

Nấm linh chi thường mọc trên cây thân gỗ (thường thuộc bộ

đậu Fabales) đã chết. Quả thể gặp nhiều nhất vào mùa mưa (thừ

tháng 5 – tháng 11 dương lịch), có thể trên thân cây.

1.2.3. Điều kiện sinh trưởng và sinh sản [3]

Yếu tố Nuôi tơ Ra quả thể

Nhiệt độ 20 - 35oC 25 – 30oC

Độ ẩm 55 – 60% 90 – 95%

Ánh sáng Không cần ánh sáng Ánh sáng tán xạ

5

1.2.4. Thành phần hoá học và dược tính cơ bản của nấm

linh chi lim xanh

Từ những năm 1980 đến nay, bằng các phương pháp hiện

đại, đã xác định được chính xác gần 100 hoạt chất và dẫn xuất trong

nấm linh chi.

1.2.5. Tác dụng của nấm linh chi [16]

Linh chi có công dụng nâng cao thể chất, nâng cao khả năng

thích ứng của cơ thể, nâng cao khả năng kháng bệnh, khả năng phục

hồi sức khoẻ.

1.2.6. Giới thiệu sơ lược về hoạt chất sinh học có trong

nấm linh chi.

Nấm linh chi lim xanh (Ganoderma lucidum) cũng như một số

nấm linh chi làm dược liệu khác có chứa nhiều dược chất có tác dụng

kéo dài tuổi thọ, ức chế khối u, hạ huyết áp,… như: polysaccharide,

saponin, triterpenoide, gamanium các acid gnoderic,…

1.3. NGUYÊN LIỆU TRỒNG NẤM

Linh chi là loài nấm phá gỗ mạnh, có khả năng sử dụng trực

tiếp nguồn xelluloza. Do đó, nguyên liệu nào có xelluloza thì nấm

linh chi có thể sống và phát triển.

1.4. SƠ LƯỢC VỀ XÃ TIÊN LÃNH – TIÊN PHƯỚC – QUẢNG

NAM

Xã Tiên Lãnh nằm dọc bờ đông sông Tranh, là địa đầu phía

Tây của huyện Tiên Phước; phía Đông của xã Tiên Ngọc; phía Tây

và Tây Bắc giáp hai xã Phước gia, Thăng Phước của huyện Hiệp

Đức; phía Nam giáp Trà Đốc (huyện Trà My).

1.5. GIỚI THIỆU VỀ CÂY LIM XANH

Là cây gỗ lớn, thường xanh cao trên 30 m. Tán lá dày, xoè

rộng, thân thẳng, tròn, gốc có bạnh nhỏ.

6

CHƯƠNG 2

ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Nấm linh chi lim xanh (Ganoderma lucidum) tại tiểu khu

556 - xã Tiên Lãnh - Tiên Phước - Quảng Nam.

2.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.2.1. Địa điểm thu mẫu ngoài thực địa

- Địa điểm nơi lấy mẫu: xã Tiên Lãnh huyện Tiên Phước tỉnh

Quảng Nam

2.2.2. Địa điểm nghiên cứu thí nghiệm

- Địa điểm tiến hành thí nghiệm: Phòng thí nghiệm vi sinh

của khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư Phạm Đà Nẵng,

trung tâm đo lường chất lượng khu vực II

- Địa điểm trồng nấm: tổ 14, phường Hòa Khánh Nam, quận

Liên Chiểu, TP Đà Nẵng và thôn 1 – xã Tiên Lãnh –Tiên Phước –

Quảng Nam.

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phương pháp phỏng vấn [1]

2.3.2. Phương pháp khảo sát thực địa [1]

Mỗi tháng chúng tôi tiến hành khảo sát thực địa 1 đợt, mỗi

đợt từ 2 đến 3 ngày trên 3 tuyến được xác định từ trước và khảo sát

liên tục từ tháng 2 đến tháng 12/ 2012.

2.3.3. Phương pháp Quadrat (Ô tiêu chuẩn) [1]

Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài tôi đã chọn kích thước

100m2 (10m x 10m), ở khu vực có địa hình dốc gây khó khăn cho

việc điều tra thì chọn ô nhỏ có kích thước 25m2

(5m x 5m).

7

2.3.4. Phương pháp xác định độ ẩm cơ chất [20]

Độ ẩm (W) của gỗ được tính theo công thức sau:

W = (Gs-Ggo) / Ggo × 100%, W1 = (Gs-Ggo) / Gs × 100%

Trong đó: W - độ ẩm tuyệt đối của gỗ; W1 - độ ẩm tương đối của gỗ;

Gs - trọng lượng của gỗ ướt; Ggo — trọng lượng gỗ đã sấy khô.

2.3.5. Phương pháp quan sát hệ sợi nấm

- Lấy một ít sợi nấm dàn đều vào 1 giọt nước có trên lam

kính

- Nhuộm bằng dung dịch xanh metylen trong 5 – 10 phút

- Quan sát mẫu vật dưới vật kính x100

2.3.6. Phương pháp quan sát bào tử nấm linh chi lim xanh

(Garnodema lucidum)

- Lấy quả thể nấm linh chi lim xanh (Garnodema lucidum)

trong giai đoạn phóng thích bào tử.

- Cố định bào tử trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới

của lam kính qua ngọn lửa đèn cồn đến khô

- Quan sát bào tử nấm dưới vật kính x100

2.3.7. Phương pháp phân lập giống từ quả thể nấm

Dùng dao mổ vô trùng và bằng thao tác vô trùng cắt một mẫu

nhỏ tổ chức ở vị trí cuống nấm hay mũ nấm rồi dùng que cấy đưa vào

đĩa petri đã có môi trường thạch hay ống nghiệm thạch nghiêng đã vô

trùng.

2.3.8. Phương pháp nhân giống cấp I

Thí nghiệm được bố trí với 5 công thức, mỗi công thức 10

đĩa với 3 lần lặp lại:

8

Bảng 2.1. Các môi trường nhân giống cấp I

Công thức Môi trường nuôi cấy

1 PDA

2 PDA + 10% dịch chiết cà rốt

3 PDA + 10% nước dừa

4 Czaper – Dox.

5 Muzino

Tổng số đĩa cấy: 120 đĩa

Các chỉ tiêu theo dõi sau khi cấy 2 ngày:

- Đo tốc độ lan tơ nấm (cm/ngày)

- Quan sát màu sắc và hình thái sợi nấm

2.3.9. Phương pháp nhân giống cấp II

Thí nghiệm được bố trí với 3 công thức, mỗi công thức 10

chai với 3 lần lặp lại.

Bảng 2.2. Các môi trường nhân giống cấp II

Công thức Công thức môi trường

1 95% thóc luộc + 5% cám gạo

2 95% thóc luộc + 5% cám bắp

3 99% thóc luộc + 1% bột nhẹ

Tổng số chai đem cấy: 90 chai

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tốc độ lan sâu của sợi nấm 3 ngày/lần

- Quan sát màu sắc, đặc điểm sợi nấm

2.3.10. Phương pháp nuôi trồng nấm

Cách tiến hành: Mùn cưa cao su và mùn cưa lim xanh khô

được bổ sung vôi bột với tỷ lệ 0,25% (theo trọng luợng khô của mùn

cưa), bổ sung nước, trộn đều và ủ qua đêm. Độ ẩm của cơ chất mùn

cưa đã ủ vôi qua đêm khoảng 45%.

Trộn đều các loại giá thể tổng hợp trên với nước sạch đạt

đến độ ẩm 65 ± 2% và đóng vào túi nilon PP. Sau đó tiến hành làm

9

nút bông và hấp thanh trùng ở nhiệt độ 1210C/ 1,5 – 2giờ.

2.3.11. Phương pháp thanh trùng

Cho các túi (bịch) nguyên liệu vào nồi áp suất ở nhiệt độ

119 - 126oC, áp suất đạt 1,2 - 1,5 at trong thời gian 90 - 120 phút.

2.3.12. Phương pháp nuôi sợi và bảo quản giống nấm

Giống sau khi cấy truyền phải được nuôi dưỡng trong điều

kiện thích hợp, các giống khác nhau sẽ được nuôi trong các chế độ

khác nhau về nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng.

2.3.13. Phương pháp xác định dược chất có trong nấm lim xanh.

a. Phương pháp xác định hợp chất saponin

Chiết 10 gam dược liệu với cồn 70% bằng cách ngâm trong

24 giờ rồi lọc. Cô dịch lọc bốc hơi đến cắn khô. Dùng cắn để làm các

phản ứng định tính.

- Thử nghiệm tính tạo bọt

- Thử nghiệm Fontan – Kaudel

b. Định tính triterpenoid

Lấy 5 ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hới tới cắn.

Hòa tan cắn với 0,5 ml anhydrid acetic và 0,5 ml chloroform. Chuyển

dung dịch vào 1 ống nghiệm nhỏ khô, dùng pipet pasteur thêm cẩn

thận 1 - 2 ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiên cho acid

chảy xuống đáy ống nghiệm. Kết luận có triterpenoid.

c. Phương pháp định tính axit hữu cơ

Lấy 2 ml dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm. Thêm vào

dung dịch một ít tinh thể natri Na2CO3. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên

từ các tinh thể Na2CO3 thì kết luận là có acid hữu cơ.

d. Phương pháp định lượng polysaccharides

Chiết GLPs ở 100oC trong 16 giờ, cho năng suất ly trích cao.

2.3.14. Phương pháp xử lí số liệu

Các kết quả phân tích được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học.

10

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. HÌNH THÁI GIẢI PHẪU CỦA NẤM LINH CHI LIM

XANH (GARNODERMA LUCIDUM)

3.1.1. Hình thái quả thể nấm linh chi lim xanh

(Garnodema lucidum)

+ Quả thể nấm linh chi lim xanh (Garnoderma lucidum) thu

hái được có cuống ngắn, đính bên, cuống nấm to. mầm nấm có dạng

hình tròn, tai nấm có màu trắng đến màu vàng chanh – vàng cam.

+ Mặt dưới thể quả thường màu trắng kem – hơi vàng, có

nhiều lỗ nhỏ. Đây là lớp bào tầng sinh sản của nấm, chính những lỗ

này là nơi phóng thích bào tử khi quả thể trưởng thành.

3.1.2. Hệ sợi nấm linh chi lim xanh (Garnoderma

lucidum)

Sợi nấm hình trụ, có phân nhánh, mọc đan xen tạo thành hệ sợ

chằng chịt.

3.1.3. Cấu trúc bào tử nấm linh chi lim xanh

(Garnoderma lucidum)

Bào tử đảm (Basidiospores) có màu nâu quế, hình trứng.

Bào tử có cấu trúc lớp vỏ kép, bên trong chứa dịch trong suốt. Lớp vỏ

ngoài nhẵn. . Bào tử nấm có kích thước trung bình 4.5 – 6,5µm x 8,5

– 11,5µm.

3.1.4. Sơ bộ định danh nấm linh chi lim xanh thu tại xã

Tiên Lãnh - Tiên Phước -Quảng Nam.

Dựa vào sự định loại của các chuyên gia là PGS.TS Lê Đình

Thám và PGS.TS Lê Bá Dũng (ĐH Đà lạt) [1]. Từ đây, có thể kết

luận được quả thể nấm linh chi lim xanh thu thập được tại xã Tiên