Nghiên cứu đặc điểm gen H5 và N1 của virus cúm A/H5N1 phân lập tại Việt Nam để tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vaccine thế hệ mới

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNCÔNG NGHỆ

SINH HỌC

NGUYỄN THỊ BÍCH NGA

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM GEN H5 VÀ N1 CỦA VIRUS

CÚM A/H5N1 PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM ĐỂ TẠO NGUỒN

NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VACCINE THẾ HỆ MỚI

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ị T

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Ng-êi

NĂM 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện và một số kết quả cùng cộng tác

với các cộng sự khác.

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được

công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các

đồng tác giả.

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Ngày tháng năm 2012

Tác giả

Nguyễn Thị Bích Nga

v

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các ký hiệu , các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

i

ii

iii

vi

vii

viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ VIRUS CÖM 4

1.1.1. Virus cúm và phân loại virus cúm 4

1.1.2. Đặc điểm tiến hóa tạo nên các phân dòng có độc lực cao của virus

cúm A/H5N1

5

1.1.3 Sự hình thành genotype của virus cúm A/H5N1 trên thế giới và Việt

Nam

7

1.1.4 Biến đổi thành phần gen hemagglutinin (HA) tạo nên các nhóm

kháng nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1

9

1.2. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VIRUS CÚM A 11

1.2.1. Đặc tính cấu trúc chung 11

1.2.2. Cấu trúc hệ gen của virus cúm A 13

1.2.3. Chức năng các phân đoạn trong hệ gen 14

1.3. CẤU TRÖC, CHỨC NĂNG CỦA HEMAGGLUTININ VÀ

NEURAMINIDASE

15

1.3.1. Protein hemagglutinin (HA) 15

1.3.2. Protein neuraminidase (NA) 19

1.4. CÁC YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH ĐỘC LỰC 21

1.5. CÁC PHƢƠNG THỨC BIẾN ĐỔI KHÁNG NGUYÊN 22

1.5.1. Hiện tƣợng «lệch kháng nguyên» 22

1.5.2. Hiện tƣợng «trộn kháng nguyên» 24

1.5.3. Hiện tƣợng glycosyl hoá 24

1.6. BỆNH CÖM GIA CẦM 25

1.6.1. Lịch sử bệnh cúm gia cầm 25

1.6.2. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới 27

1.6.3. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở Việt Nam 28

1.6.4. Đặc điểm của bệnh cúm gia cầm 28

1.6.4.1. Triệu chứng - bệnh tích ở cúm gia cầm 28

v

1.6.4.2. Triệu chứng bệnh cúm gia cầm ở người 29

1.6.5. Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1 29

1.6.6. Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A trong tế bào 31

1.6.7. Phƣơng thức lây truyền của virus cúm gia cầm 32

1.6.8. Sức đề kháng của virus 33

1.7. CÁC LOẠI VACXIN PHÕNG BỆNH CHO GIA CẦM 33

1.8. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ VIRUS CÖM GIA CẦM A/H5N1 TẠI VIỆT

NAM

36

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1. ĐỐI TƢỢNG 39

2.2. NỘI DUNG 39

2.3. VẬT LIỆU 39

2.4. DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 40

2.4.1. Dụng cụ, trang thiết bị 40

2.4.2. Hóa chất 40

2.5. QUI TRÌNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH GEN H5 VÀ N1 CỦA VIRUS

CÚM A/H5N1

40

2.6. CÁC PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ NGHIÊN CỨU GEN

VIRUS CÚM A/H5N1

41

2.6.1. Phƣơng pháp tách chiết ARN tổng số 41

2.6.2. Phƣơng pháp RT-PCR 42

2.6.3. Phƣơng pháp điện di kiểm tra và tinh sạch sản phẩm RT-PCR 42

2.7. PHƢƠNG PHÁP DÕNG HÓA 43

2.7.1. Nối sản phẩm RT-PCR/PCR vào vector tách dòng 43

2.7.2. Chuyển nạp sản phẩm dòng hóa vào tế bào khả biến 44

2.7.3. Chọn lọc, nuôi cấy khuẩn lạc và tách chiết ADN tái tổ hợp 45

2.7.4. Kiểm tra ADN tái tổ hợp 45

2.8. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE 45

2.9. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 47

2.9.1. Xử lý chuỗi trong chƣơng trình Chromas 47

2.9.2. Chƣơng trình biên tập chuỗi nucleotide SeqEd 48

2.9.3. Hệ chƣơng trình MacVector 48

2.9.4. Chƣơng trình so sánh và phân tích chuỗi gen GeneDoc 48

2.9.5. Chƣơng trình phân tích di truyền tiến hóa phân tử (MEGA) 49

2.9.6. Xử lý số liệu trong nghiên cứu 49

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 50

3.1. THU NHẬN VÀ LƢU GIỮ GEN H5 CỦA VIRUS CÖM A/H5N1 50

v

TRONG VECTOR TÁCH DÒNG

3.1.1. Tách ARN tổng số và thực hiện RT-PCR 50

3.1.2. Dòng hoá sản phẩm và lƣu gen H5 trong vector tách dòng 52

3.1.3. Giải trình tự và phân tích thành phần amino acid của HA (H5) so

sánh về thành phần nucleotide và amino acid với các chuỗi đăng ký

trong Ngân hàng gen

54

3.1.4. Phân tích vị trí điểm cắt protease, bám dính thụ thể, epitope và

glycosyl hoá của polypeptide H5 trên cơ sở trình tự amino acid suy

diễn

65

3.1.5. Phân tích tƣơng đồng về nucleotide và amino acid ở H5 67

3.1.6. Phân tích mối quan hệ phả hệ và nguồn gốc giữa các chủng của Việt

Nam và thế giới

69

3.2. XÁC ĐỊNH CÁC PHÂN NHÁNH NHÓM KHÁNG NGUYÊN (CLADE)

XUẤT HIỆN MỚI TẠI VIỆT NAM

73

3.2.1 Kết quả sự hình thành phân nhóm kháng nguyên mới 1.1 của clade 1 74

3.2.2 Kết quả sự hình thành phân nhóm kháng nguyên mới của clade 2.3.2

và 2.3.4

76

3.3. THU NHẬN, GIẢI TRÌNH TỰ VÀ LƢU GIỮ GEN N1 CÁC CHỦNG

VIRUS CÚM A/H5N1 TRONG VECTOR TÁCH DÒNG

79

3.3.1. Thực hiện RT-PCR thu nhận gen N1 79

3.3.2. Dòng hoá sản phẩm gen N1 trong vector tách dòng 81

3.3.3. Phân tích thành phần nucleotide và amino acid của gen N1 83

3.3.3.1. Phân tích thành phần nucleotide gen N1 83

3.3.3.2. Phân tích thành phần amino aicd gen N1 85

3.3.4. Phân tích đột biến trƣợt-xoá gen của N1 qua thời gian tiến hoá 89

3.3.5. Phân tích mối quan hệ phả hệ gen N1 của các chủng virus cúm

A/H5N1 giai đoạn 1996 - 2011

92

KẾT LUẬN 98

ĐỀ XUẤT VÀ KIẾN NGHỊ 99

TÀI LIỆU THAM KHẢO 100

DANH SÁCH CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ CÔNG BỐ 114

PHỤ LỤC

vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

bp base pair Cặp bazơ

Ck Chicken Gà

dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate Deoxy Nucleotide Triphosphate

ddNTP dideoxy Nucleotide Triphosphate dideoxy Nucleotide Triphosphate

Dk Duck Vịt

DNA Acid deoxyribonucleic Axit deoxyribonucleic

FAO Food and Agricultural Organization Tổ chức nông lương thế giới

Gs Goose Ngỗng

HA Hemagglutinin Kháng nguyên HA

HI Hemagglutination Inhibition Phản ứng ngưng kết hồng cầu

HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực cao

kb Kilo base Kilo base

kDa Kilodalton Đơn vị khối lượng kilodalton

LB Luria-Bertani medium Môi trường LB

LPAI Low Pathogenic Avian Influenza Cúm gia cầm thể độc lực thấp

M Matrix protein Protein đệm M

Md Muscovy duck Ngan

MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis Phân tích di truyền tiến hoá phân tử

NA Neuraminidase Kháng nguyên NA

NEP Nuclear Export Protein Nuclear Export Protein

NP Nucleoprotein Nucleoprotein

NS Non-structural protein Protein không cấu trúc

OIE Office International des Epizooties Tổ chức dịch tễ thế giới

PA Polymerase acidic protein Protein PA

PB1 Polymerase basic protein 1 Protein PB1

PB2 Polymerase basic protein 2 Protein PB2

RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic

RNP Ribonucleoprotein Ribonucleoprotein

RT-PCR Revertranscription Polymerase Chain

Reaction

Phản ứng trùng hợp chuỗi PCR

ngược

SPF Specific Pathogen Free Không tác nhân mầm bệnh

WHO World Health Organization Tổ chức Y thế thế giới

vi

ix

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Thống kê số lượng người bị nhiễm và chết do cúm gia cầm qua

các năm.

26

Bảng 2.1 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 phân lập giai đoạn

2004 – 2011.

39

Bảng 2.2 Danh sách các cặp mồi sử dụng trong thu nhận gen kháng

nguyên H5 và N1.

42

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng RT-PCR và chu trình nhiệt. 42

Bảng 2.4 Danh sách các cặp mồi sử dụng trong giải trình tự gen kháng

nguyên H5 và N1.

47

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt giải trình tự. 47

Bảng 3.1 Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế

giới sử dụng chuỗi H5 trong phân tích so sánh thành phần gen và

mối quan hệ nguồn gốc phả hệ.

54

Bảng 3.2 Các vị trí nucleotide sai khác trong chuỗi H5 giữa các chủng so

sánh.

56

Bảng 3.3 Kết quả tổng hợp phát hiện 41 vị trí sai khác amino acid của

chuỗi H5 so sánh ở 32 chủng phân lập tại Việt Nam từ năm 2004

- 2011.

64

Bảng 3.4 Các vị trí amino acid quan trọng trong chuỗi polypeptide H5 65

Bảng 3.5 Tỷ lệ (%) tương đồng về nuleotide (trên đường chéo) và amino

acid (dưới đường chéo) của gen H5.

68

Bảng 3.6 Kết quả thống kê 14 chủng virus cúm AH5N1 được xác định gen

H5 và các nhóm kháng nguyên giai đoạn 2004 – 2011 trong

nghiên cứu.

78

Bảng 3.7 Danh sách các chủng cúm A/H5N1 thu thập qua các năm 2004-

2011 đã giải trình tự và cung cấp chuỗi gen N1 sử dụng để so

sánh nucleotide và amino acid.

83

Bảng 3.8 Kết quả thống kê 14 chủng virus cúm A/H5N1 giai đoạn 2004-

2011 đã được giải trình tự và đăng ký gen N1

97

ix

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Dịch tễ học các biến chủng virus cúm A ở khu vực Đông Nam Á 6

Hình 1.2 (A) Hình thành genotype trong quá trình tiến hóa từ các nguồn gen

khác nhau. (B) Các genotype bắt đầu từ khi mới xuất hiện thể độc

lực cao HPAI tạo thành từ các trao đổi chéo tiến hóa tạo genotype

mới tại Việt Nam từ 2001 – 2007.

8

Hình 1.3 Quá trình tái tổ hợp và sự hình thành các genotype của virus cúm

A/H5N1

8

Hình 1.4 (A)Ảnh các dạng hình thái của virus cúm A được nhuộm âm tính

trên kính hiển vi điện từ truyền qua. (B) Mô hình cấu tạo hạt virus

cúm A. (C) Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP của

virus cúm.

12

Hình 1.5 Mô hình cấu trúc hemagglutinin. 16

Hình 1.6 Minh họa đột biến điểm của hiện tượng “lệch kháng nguyên”

(antigenic drift) ở virus cúm A.

23

Hình 1.7 Minh họa đột biến tái tổ hợp của hiện tượng “trộn kháng nguyên”

(antigenic shift) của virus cúm A.

24

Hình 1.8 Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng vật chủ của biến chủng virus

cúm A.

30

Hình 1.9 Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A trong tế bào. 31

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu sinh học phân tử virus cúm A/H5N1. 41

Hình 2.2 Cấu trúc của vector pCR

2.1- TOPO 43

Hình 3.1 Điện di sản phẩm RT-PCR gen H5 của 14 chủng virus cúm

A/H5N1trên thạch agarose 1%.

51

Hình 3.2 Kết quả tách dòng ADN tái tổ hợp gen H5 của 14 chủng virus

cúm A/H5N1 và điện di trên agarose 1% .

53

Hình 3.3 Trình bày so sánh trình tự amino acid chuỗi polypeptide H5 của 33

chủng (có 14 chủng phân lập 2004-2011 tại Việt Nam thuộc

nghiên cứu này) với các chủng liên quan có trong Ngân hàng gen

trong danh sách liệt kê ở Bảng 3.1

61

Hình 3.4 Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa các chủng cúm A/H5N1 xác

lập dựa trên thành phần nucleotide gen H5 sử dụng chương trình

MEGA4.0.

70

Hình 3.5 Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa các chủng cúm A/H5N1 dựa

trên thành phần amino acid của polypeptie H5 sử dụng chương

71

ix

trình MEGA4.0.

Hình 3.6 Cây phả hệ sự hình thành phân nhóm kháng nguyên mới clade 1.1

của clade 1 dựa trên thành phần nucleotide gen H5

74

Hình 3..7 Cây phả hệ sự hình thành phân nhóm mới của clade 1 và 1.1 dựa

trên thành phần amino acid của H5

75

Hình 3.8 Cây phả hệ sự hình thành phân nhóm mới của clade 2.3..2.1 và

2.3.4.3 dựa trên thành phần nucleotide của H5.

77

Hình 3.9 Cây phả hệ sự hình thành phân nhóm mới của clade 2.3.2 và 2.3.4

dựa trên thành phần amino acid của H5.

77

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR gen N1 trên thạch agarose 1%

của 14 chủng:virus cúm A/H5N1

80

Hình 3.11 Kết quả tách dòng các DNA tái tổ hợp và điện di trên thạch

agarose 1% gen N1 của 14 chủng virus cúm A/H5N1.

81

Hình 3.12 So sánh đối chiếu trình tự amino acid của N1 giữa các chủng virus

cúm A/H5N1 thu thập qua các năm 2004 -2011.

89

Hình 3.13 Vị trí của các nucleotide protein N1 có đột biến trượt-xoá ở các

chủng nghiên cứu (2004 - 2011) so với các chủng liên quan trong

Ngân hàng gen.

90

Hình 3.14 Vị trí các amino acid của chuỗi polypeptide N1 có đột biến trượt￾xoá ở 14 chủng nghiên cứu (2004-2011) so sánh với các chủng

liên quan có trong Ngân hàng gen.

91

Hình 3.15 Cây phả hệ biểu thị mối quan hệ nguôn gốc phả hệ giữa các chủng

cúm A/H5N1 dựa trên phân tích thành phần nucleotide gen N1 sử

dụng chương trình MEGA4.0.

94

Hình 3.16 Cây phả hệ biểu thị mối quan hệ nguôn gốc phả hệ giữa các chủng

cúm A/H5N1 dựa trên phân tích thành phần amino acid

polypeptise N1 sử dụng chương trình MEGA4.0.

96

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI) do

virus cúm A/H5N1 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh với tỷ

lệ gây chết cao trong đàn gia cầm bị bệnh. Virus cúm A/H5N1 là một phân type trong

nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, có protein Hemagglutinin (HA) và

Neuraminidase (NA) trên bề mặt capsid của hạt virus mang tính kháng nguyên tham

gia quá trình đáp ứng miễn dịch. Kháng nguyên HA có 16 phân type (ký hiệu từ H1

đến H16) và kháng nguyên NA có 9 phân type (ký hiệu từ N1 đến N9).

Kháng nguyên HA được mã hóa bởi phân đoạn 4 của hệ gen virus cúm A, có

đặc tính kết hợp với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng của tế bào nhiễm. HA có khả

năng đột biến trong gen tạo nên sự khác biệt làm thay đổi tính kháng nguyên, đặc biệt

là “vùng kháng nguyên 2” (vị trí 152 – 157) và điểm cắt của enzym protease ở vị trí

chuỗi nối giữa HA1 và HA2) hoặc tái tổ hợp biến chủng làm thay đổi kháng nguyên bề

mặt dẫn đến sự thay đổi tương quan đáp ứng miễn dịch.

Kháng nguyên NA do phân đoạn 6 mã hóa, đây là một protein bề mặt làm

nhiệm vụ enzym phân giải thụ thể tế bào và cắt liên kết glycosid của phân tử acid sialic

(N-acetylneuramic acid) giải phóng virus trong quá trình lây nhiễm.

Từ năm 2003 đến nay, virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao gây dịch cúm gia cầm

đã bùng phát ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Dịch cúm gia cầm liên

tục tái phát hàng năm với tốc độ lây lan nhanh và diễn biến phức tạp tại nhiều quốc gia.

Đặc biệt, chủng virus cúm A/H5N1 có thể xâm nhiễm gây bệnh ở người với tỉ lệ tử

vong rất cao và đang trở thành mối đe dọa nguy hiểm cho sức khỏe cộng đồng.

Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm bắt đầu xuất hiện từ những tháng cuối năm

2003 đầu năm 2004 và đã nhanh chóng lan rộng ở hầu hết các địa phương trong cả

nước. Hàng chục triệu gia cầm và thuỷ cầm đã bị chết hoặc bị tiêu hủy gây thiệt hại

kinh tế nặng nề cho ngành chăn nuôi. Năm 2011 và những tháng đầu năm 2012 đến

nay, dịch cúm A/H5N1 bùng nổ với clade clade 2.3.2.1 xuất hiện mới tại Việt Nam,

2

làm cho tình hình dịch tễ mối quan hệ lây nhiễm và phòng chống bằng vaccine càng

phức tạp hơn.

Tìm hiểu sự thay đổi phân tử các vật liệu di truyền của virus cúm A/H5N1, đặc

biệt là đặc điểm phân tử phân đoạn gen kháng nguyên HA (H5) và NA (N1) ở các

chủng phân lập trên gia cầm tại Việt Nam trong giai đoạn 2004 đến nay là cần thiết,

nhằm đánh giá cấu trúc gen, khả năng tiến hoá của virus liên quan đến thay đổi đặc

điểm kháng nguyên để từ đó có thể đưa ra những dự báo về dịch tễ học ở mức độ phân

tử, định hướng sử dụng nguồn gen kháng nguyên để sản xuất và sử dụng vaccine

phòng bệnh cúm gia cầm thích hợp đạt hiệu quả.

Xuất phát từ những yêu cầu trên chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu đặc điểm gen H5 và N1 của virus cúm A/H5N1 phân lập tại

Việt Nam để tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vaccine thế hệ mới”.

2. Mục tiêu của đề tài

1- Giải mã toàn bộ phân đoạn gen kháng nguyên H5 và N1 một số chủng virus cúm

A/H5N1 thu nhận tại một số địa phương của Việt Nam giai đoạn 2004 - 2011.

2- Lưu giữ các gen H5 và N1 trong vector tách dòng để làm nguồn vật liệu cho

nghiên cứu tiếp theo làm nguyên liệu để tạo vaccine thế hệ mới.

3- Phân tích đặc điểm sinh học phân tử các gen kháng nguyên H5 và N1, xác định

mối quan hệ phả hệ với các chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1. Ý nghĩa khoa học

Đây là công trình giải trình tự toàn bộ gen H5 và N1 theo cặp trong hệ gen của

từng chủng của virus cúm A/H5N1 đại diện của một số địa phương tại Việt Nam được

phân lập theo thời gian từ năm 2004 – 2011.

Các kết quả phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ trong nghiên cứu này cho

thấy sự đa nhiễm các clade của virus cúm gia cầm ở từng thời điểm, từ khi xuất hiện tại

Việt Nam đến nay, đó là clade 1, 1.1, clade 2.3.4 (2.3.4.3) và clade 2.3.2 (2.3.2.1) tại

Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử sử dụng kỹ thuật RT-PCR và giải trình

tự chuỗi nucleotide để phân tích thành phần gen.