Mục đích của công tác chọn giống và nhân giống là cải tiến tiềm năng di truyền của cây trồng, vật

57

Chương 2

Các phương pháp chuyển gen

Nhiều phương pháp khác nhau đã được phát minh để đưa gen

vào tế bào và mô động vật và thực vật. Kỹ thuật đơn giản nhất là

chuyển DNA trần bằng vi tiêm (microinjection), xung điện

(electroporation), súng bắn gen. Các phương pháp phức tạp và hiệu

quả hơn bao gồm sử dụng các phức hợp lipid-DNA (liposome),

vector virus, tế bào gốc phôi, chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn

Agrobacterium, chuyển gen bằng súng bắn gen... Tuỳ thuộc vào đối

tượng chuyển gen mà người ta lựa chọn phương pháp chuyển gen

phù hợp.

I. DEAE-dextran

DEAE-dextran là một polycation. Ðây là tác nhân hóa học

đầu tiên được sử dụng để chuyển DNA vào tế bào động vật nuôi cấy.

Trong phương pháp này, DNA ngoại lai được cho vào một

trường nuôi cấy với sự có mặt của DEAE-dextran. DEAE-dextran sẽ

kết hợp với DNA tích điện âm (Hình 2.1). Sự dư thừa điện tích

dương trong phức hợp DNA-polycation do sự đóng góp của

polycation, cho phép phức hợp này đi đến kết hợp chặt chẽ hơn với

màng tế bào tích điện âm. Sự xâm nhập của phức hợp có thể đạt

được nhờ sự nhập bào (endocytosis).

Hình 2.1: Sự kết hợp giữa DEAE-dextran và DNA

58

Phương pháp này được sử dụng thành công trong việc chuyển

DNA vào các tế bào biểu hiện nhất thời, có nghĩa là thời gian biểu

hiện ngắn chỉ vài ngày trong quá trình nghiên cứu. Tuy nhiên,

phương pháp này nói chung là không hữu ích đối với các nghiên cứu

cần sự chuyển nhiễm ổn định dựa vào sự hợp nhất của DNA ngoại

lai vào nhiễm sắc thể, hiệu quả biến nạp thấp, chỉ được sử dụng cho

một số loại tế bào và cho kết quả tốt đối với tế bào ex vivo.

Các polycation khác cũng đã được sử dụng để chuyển DNA

vào tế bào như polybrene, polyethyleneimine và dendrimers.

II. Kỹ thuật calcium phosphate

Kỹ thuật calcium phosphate (calcium phosphate technique) đã

được phát triển đầu tiên là để xác định sự lây nhiễm của DNA virus

(Graham,1973) và hiện nay được sử dụng rông rãi để thử nghiệm

hoạt động biến nạp của DNA virus cũng như DNA tách chiết từ các

tế bào eukaryote (Wigler, 1978; Graham, 1979; Pellicer, 1980).

Kỹ thuật này yêu cầu ủ các tế bào nhận với các chất đồng kết

tủa DNA và calcium phosphat (Hình 2.2). Kết tủa này bám vào tế

bào và sau đó sẽ hấp thụ vào tế bào qua quá trình ẩm bào (Loyter,

1982). Trong tế bào, các phân tử DNA ngoại lai nằm trong không

bào được tạo thành do ẩm bào và lysosome thứ hai nhưng rất ít DNA

đi đến nhân vả hợp nhất vào genome chủ.

Hình 2.2: Phức hợp DNA-calcium phosphat

59

Cho đến nay, đây là kỹ thuật vô cùng có giá trị đối với các

nghiên cứu chuyển gen vào các tế bào soma nuôi cấy và đang được

sử dụng nhiều để chuyển các dòng genome vào tế bào đích. Tỉ lệ các

tế bào được biến nạp ổn định của kỹ thuật này là tương đương với

phương pháp vi tiêm nhưng khác với vi tiêm là nhiều tế bào được

biến nạp cùng một lần. Hơn nữa, biến nạp DNA tách chiết từ các tế

bào ung thư vào các tế bào nhận không ung thư đã cho thấy đây là

phương pháp duy nhất để nghiên cứu sự kiểm soát di truyền của ung

thư. Phương pháp này được sử dụng phổ biến bởi vì đơn giản,

protocol dễ thực hiện, ít tốn kém, số tế bào chết sau biến nạp không

đáng kể, sự biểu hiện gen có thể là nhất thời hoặc ổn định và quan

trọng trong việc thiết kế vector virus tái tổ hợp. Tuy nhiên hiệu quả

biến nạp và mức độ biểu hiện của gen chuyển thấp.

III. Chuyển gen qua liposome

Vào thập niên 1980, liposome nhân tạo đã được sử dụng để

đưa DNA vào tế bào. Lipid với toàn bộ lưới tích điện dương ở pH

sinh lý là thành phần lipid tổng hợp phổ biến nhất của liposome

được phát triển cho chuyển gen (Hình 2.3). Thường thì lipid cation

được trộn với một lipid trung tính như L-dioleoyl phosphatidyl￾ethanolamine (DOPE) (Hình 2.4). Phần cation của phân tử lipid kết

hợp với DNA tích điện âm và kết quả là chứa đầy DNA trong phức

hợp liposome-DNA (Hình 2.5). Ðối với các tế bào nuôi cấy, toàn bộ

lưới tích điện dương của phức hợp liposome-DNA nói chung là gây

ra hiệu quả chuyển gen cao hơn bởi vì nó cho phép phức hợp này kết

hợp với màng tế bào tích điện âm bền hơn. Nhờ cơ chế nhập bào,

các phức hợp xuất hiện trong endosome và sau đó đi vào nhân (Hình

2.6). Chưa rõ DNA được phóng thích từ endosome và đi qua màng

nhân như thế nào. DOPE được xem là một lipid kích thích sự dung

hợp và vai trò của nó là phóng thích các phức hợp này từ endosome

cũng như làm cho sự dung hợp của màng tế bào phía ngoài với phức

hợp liposome-DNA xảy ra dễ dàng. Trong phương pháp này, các đại

phân tử trước hết được đưa vào trong các túi phospholipid. Các loại

túi khác nhau đã được mô tả, nhưng túi một lớp mỏng là thích hợp

nhất cho chuyển gen vì chúng có tỉ lệ khoảng trống chứa nước ở bên

trong tương đối cao đối với mỗi đơn vị lipid và bởi vì chúng có tỉ lệ