Khóa luận

Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin gửi tới bố mẹ, anh chị cùng bạn bè, những người mà đã

luôn quan tâm, ủng hộ và là chỗ dựa cho tôi trong suốt thời gian tôi làm khóa luận

này, cũng như trong cuộc sống.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Phương Thuận - chủ nhiệm

bộ môn Hóa sinh - trường ĐH Khoa học tự nhiên Hà Nội, đã giúp đỡ hết sức tận tình

để tôi hoàn thành khóa luận này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối tới TS. Nguyễn Văn Đồng đã tận tình

giúp đỡ, hướng dẫn trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ to lớn, những ý

kiến đóng góp quý báu, sự hướng dẫn tận tình của Ths. Hà Văn Chiến trong quá

trình tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm trọng điểm Công

nghệ tế bào thực vật - Viện Di truyền nông nghiệp về sự giúp đỡ nhiệt tình trong suốt

thời gian tôi thực hiện khóa luận.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường ĐH Khoa học Tự nhiên -

ĐH Quốc Gia Hà Nội đã giúp đỡ nhiệt tình và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong

thời gian học tập cũng như khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với những giúp đỡ quý báu đó.

Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2010

Bùi Thúy Hiền

Bùi Thúy Hiền - i - K51A Sinh học

Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010

KÝ HIỆU VIẾT TẮT

AS : Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone)

BAP : 6-benzylaminopurin

CaMV : Cailiflower Mosaic Virus

Car : Carbenicillin

DNA : Deoxirionucleic Acid

FAO : Food and Agriculture Organization

GFP : Green Fluorescent Protein

Gus : β-1,4-Glucuronidase

HPT : Hygromycin Phosphotransferase

ISAAA : International Services for the Acquisition of Agri-Biotech

Ka : Kanamycin

LB : Luria Bertani

L-Cys : L-Cystein

MS : Murashige and Skoog, 1962

α-NAA : α-Napthalene acetic acid

NPT II : Neomycin Phosphotransferase II

PCR : Polymerase Chain Reaction

Ti-plasmid : Tumor-Including Plasmid

T-DNA : Transfer-DNA

USDA : United States Department of Agriculture

Vir : virulence

Bùi Thúy Hiền - ii - K51A Sinh học

Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010

DANH MỤC HÌNH VẼ

Bùi Thúy Hiền - iii - K51A Sinh học

Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây9

Bảng 2. Tình hình sản xuất đậu tương của 4 nước đứng đầu trên thế giới

trong những năm gần đây..........................................................................................9

Bảng 3. Các nước nhập khẩu đậu tương hàng đầu Châu Á (nghìn tấn) 10

Bảng 4. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam những năm gần đây

.....................................................................................................................................10

Bảng 5. Hệ thống các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker genes) và

các gen chỉ thị sàng lọc (screenable marker genes)...............................................16

Bảng 6. Nồng độ và thời gian khử trùng của Ethanol và NaClO............38

Bảng 7. Kết quả thí nghiệm thử nồng độ và thời gian khử trùng............38

Bảng 8. Kết quả biểu hiện của ĐT26 đối với các chủng vi khuẩn...........40

Bảng 9. Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang

của dung dịch ...........................................................................................................41

Bảng 10. Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp......43

Bảng 11. Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp......46

Bảng 12. môi trường MS (PH=5,6-5,8).......................................................59

Bảng 13. Môi trường LB (PH = 7)...............................................................59

Bảng 14. Môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu..............................................60

Bùi Thúy Hiền - iv - K51A Sinh học

Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. i

KÝ HIỆU VIẾT TẮT ..................................................................................... ii

DANH MỤC HÌNH VẼ ................................................................................. iii

DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... iv

MỤC LỤC ........................................................................................................ v

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

Chương I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4

1.1. Giới thiệu chung về đậu tương ...................................................................... 4

1.1.1. Nguồn gốc ..................................................................................... 4

1.1.2. Phân loại ........................................................................................ 4

1.1.3. Vai trò của đậu tương .................................................................... 4

1.1.4. Sinh thái đậu tương ........................................................................ 6

1.1.5.2. Tính chịu hạn ....................................................................................... 7

1.1.5.3. Tính chịu đựng và khả năng phục hồi ................................................. 7

1.1.5.4. Biến động di truyền về phản ứng với yếu tố bất lợi ........................... 8

1.1.6. Đặc tính sinh học của giống đậu tương ĐT26 ................................ 8

1.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam ........................... 9

1.2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới ..................................... 9

1.2.2. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam .................................... 10

1.3. Vi khuẩn A.tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen ở thực vật ............. 11

1.3.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn A. tumefaciens ............................... 11

1.3.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid ......................................... 12

1.3.3. Cấu trúc và chức năng của T-ADN .............................................. 13

1.3.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens .... 13

1.3.5. Các vector biến nạp thực vật không gây ung thư dựa trên Ti-

plasmid ............................................................................................................. 14

1.3.6. Các gen chỉ thị chọn lọc và sàng lọc ............................................ 15

Bùi Thúy Hiền - v - K51A Sinh học

Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010

1.3.7. Hệ thống vector pCAMBIA ......................................................... 17

1.3.8. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp thông qua

A.tumefaciens .................................................................................................. 19

1.4. Cây trồng biến đổi gen và cây đậu tương biến đổi gen ............................. 21

1.4.1. Cây trồng biến đổi gen trên thế giới và việt nam .......................... 21

1.4.2. Cây đậu tương biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam ................. 22

Chương II - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 24

2.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 24

2.1.1. Các thiết bị thí nghiệm ................................................................ 24

2.1.2. Hóa chất và môi trường ................................................................ 24

2.1.3. Vi khuẩn ...................................................................................... 24

2.1.4. Đối tượng nghiên cứu .................................................................. 24

2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 24

2.2.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng ......................................................... 24

♦♦ Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaClO và thời gian

khử trùng ở giai đoạn khử trùng mẫu. ........................................................................ 24

2.2.2. Chuyển gen gus vào đậu tương .................................................. 25

♦♦ Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất với

ĐT26 ............................................................................................................................ 25

♦♦ Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch

khuẩn (OD) đến khả năng biểu hiện gus của ĐT26. .................................................. 27

♦♦ Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu

quả chuyển gen gus vào ĐT26. ................................................................................... 29

♦♦ Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá

mầm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐT26. ......................................................... 30

♦♦ Thí nghiệm 6: Xây dựng quy trình tái sinh cây chuyển gen ..................... 32

♦♦ Thí nghiệm 7: Phân tích cây chuyển gen T0 ............................................. 33

2.3. Các chỉ tiêu đánh giá ..................................................................................... 35

Chương III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 37

3.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng ......................................................................... 37

Bùi Thúy Hiền - vi - K51A Sinh học