Khảo sát và phân tích mức độ methyl hóa tại vùng promoter của gen DNMT3L trên bệnh nhân ung thư cổ tử cung / Lê Thị Trúc Linh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

KHẢO SÁT VÀ PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ METHYL HÓA

TẠI VÙNG PROMOTER CỦA GEN DNMT3L TRÊN

BỆNH NHÂN UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: ThS. LÊ THỊ TRÚC LINH

TP. HCM, Tháng 12/ 2012

i

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC HÌNH ẢNH iii

DANH MỤC BẢNG BIỂU iv

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU v

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS vii

PHẦN I: TỔNG QUAN 1

I. TỔNG QUAN VỀ EPIGENETICS VÀ SỰ METHYL HOÁ DNA 1

I.1. Định nghĩa sự methyl hóa DNA 1

I.2. Enzyme xúc tác 2

I.3. Sự methyl hoá DNA trong ung thư 3

II. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ DÙNG

ĐỂ PHÁT HIỆN SỰ METHYL HÓA DNA 4

II.1. Phương pháp MSP 4

II.1.1. Nguyên tắc MSP 4

II.1.2. Xử lý DNA bằng sodium bisulfite 5

II.1.3. Đọc kết quả phản ứng MSP 5

II.2. Phương pháp BSP (Bisulfite Sequencing PCR) 6

II.3. Phương pháp Q-MSP (Quantitative-MSP) 6

III. Mục tiêu của nghiên cứu 7

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 9

II.1. VẬT LIỆU 9

II.2. PHƯƠNG PHÁP 9

II.2.1. Khai thác dữ liệu 9

III.2.2. Khảo sát in silico 9

II.2.3. Thực nghiệm 10

II.2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA bằng phenol/chloroform 10

II.2.3.2. Xác định nồng độ DNA 11

II.2.3.3. Phương pháp biến đổi bisulfite DNA sử dụng

Epitect bisulfite kit 11

ii

II.2.3.4. Phương pháp BSP trên DNA chứng và trên

mẫu bệnh phẩm 12

II..2.3.5. Phương pháp điện di trên gel agarose 13

II.2.3.6. Giải trình tự sản phẩm BSP và hiệu chỉnh trình tự sau giải 14

PHẦN III: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 15

III.1. Kết quả khai thác dữ liệu và khảo sát in silico 15

III.1.1. DNMT3A (DNA 5-Cytosine Methyltransferase 3a) 16

III.1.2. Gen DNMT3B (DNA 5-Cytosine Methyltransferase 3B) 19

III.1.3. Gen DNMT3L 20

III.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 24

III.2.1. Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng thực nghiệm

Q-MSP sử dụng DNA chứng 24

III.2.2. Thực hiện phản ứng BSP sử dụng DNA bệnh phẩm 24

III.2.3. Thực hiện giải trình tự sản phẩm BSP 27

PHẦN IV: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 32

IV.1. KẾT LUẬN 32

IV.2.ĐỀ NGHỊ 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

iii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang

Hình I.1: Sự bổ sung nhóm –CH3 vào vị trí carbon số 5 của Cytosine thuộc cặp

nucleotide CpGtrong DNA nhờ enzyme DNA methyltransferase (DNMT) 1

Hình I.2: Sự methyl hóa bất thường tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen 2

Hình I.3: Phương pháp MSP 5

Hình I.4: Sự chuyển từ Cytosine thành Uracil trong sodium bisulfite 5

Hình I.5: Đọc kết quả MSP 6

Hình III.1. Gen DNMT3A 19

Hình III.2. Gen DNMT3B 20

Hình III.3. Gen DNMT3L 23

Hình III.4: Kết quả phân tích phản ứng QMSP và điện di

trên gel agarose sản phẩm QMSP từ cặp mồi DNMT3L 24

Hình III.5: Kết quả điện di sản phẩm BSP (3μl) từ cặp mồi

DNMT3L thực hiện trên DNA bệnh phẩm. LAD thang chuẩn 100 bp 25

Hình III.7: Kết quả điện di sản phẩm BSP (3μl) trên hai mẫu

bệnh phẩm dịch phết tế bào (31, 545) 26

Hình III.8: Kết quả điện di sản phẩm BSP (3μl) trên ha mẫu

bệnh phẩm sinh thiết mô M1 và M2 26

Hình III.9: Kết quả điện di sản phẩm BSP (3μl) trên 8 mẫu

bệnh phẩm dịch phết tế bào (1-8), 9 26

Hình III.10A. Kết quả xác định kiểu gen bằng PCR

reverse dot blot trên mẫu bệnh phẩm số 545 27

Hình III.10B. Kết quả xác định kiểu gen bằng PCR

reverse dot blot trên mẫu bệnh phẩm số 31 27

Hình III.10C. Kết quả xác định kiểu gen bằng PCR

reverse dot blot trên mẫu bệnh phẩm số M1 27

Hình III.10D. Kết quả xác định kiểu gen bằng PCR

reverse dot blot trên mẫu bệnh phẩm số M2 27

Hình III.11. Kết quả giải trình tự sản phẩm BSP mẫu số 1 28

Hình III.12. Gen DNMT3L 31