Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc chủng aspergillus, trichoderma và ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

LÊ THỊ HUỆ

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG

HỢP ENZYME CHITINASE CUA MỘT

SỐ CHỦNG NẤM SỢI THUỘC GIỐNG

ASPERGILLUS, TRICHODERMA VÀ

ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN:

PGS.TS. ĐỒNG THỊ THANH THU

TP.HCM, 2010

MỞ ĐẦU

Vi sinh vật là nhóm sinh vật có số lượng nhiều nhất và có khả năng chuyển hóa vật chất trong

thiên nhiên mạnh nhất. Hiện nay người ta khai thác nhiều enzyme từ vi sinh vật và được ứng dụng

rất nhiều trong đời sống, sản xuất. So với nguồn khai thác enzyme từ động vật và thực vật, nguồn

enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm như hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp enzyme từ vi

sinh vật rất ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, có thể sản xuất hoàn toàn theo qui mô

công nghiệp. Nhiều enzyme được khai thác từ vi sinh vật được tập trung nghiên cứu và có nhiều ứng

dụng trong thời gian qua như protease, amylase, cellulase, pectinase … Những năm sau này người ta

đang chú ý nhiều hơn về một loại enzyme khác nữa là chitinase, đây là enzyme thủy phân chitin.

Chitin là một polymer sinh học có thể so sánh với polysaccharide như cellulose. Chitin phân

bố rất rộng rãi ở dạng cấu trúc cơ bản trong thành tế bào của nấm và là bộ xương ngoài của tôm cua

và côn trùng. Đây là một polymer có trọng lượng phân tử cao, không tan trong nước, chứa các đơn

phân là N-acetyl-glucosamine liên kết bởi liên kết 1,4-β-glucoside. Chitin có nhiều công dụng trong

nhiều lĩnh vực như y học và công nghiệp…

Những enzyme có liên quan đến chuyển hóa và phân giải chitin đang được nghiên cứu nhiều

trong những năm gần đây. Chitin bị phân giải bởi hệ enzyme có tên gọi chung là chitinase. Enzyme

này được sản xuất bởi các tổ chức sống dưới tế bào để phục vụ nhu cầu chức năng sinh lý của

chúng. Sự phân giải chitin dưới tác động enzyme phụ thuộc vào các yếu tố hóa lý (tỉ lệ giữa cơ chất

và enzyme, pH, nhiệt độ…). Trong các nguồn thu nhận chitinase thì chitinase từ vi sinh vật là nguồn

quan trọng. Những nguồn sinh vật để thu nhận enzyme chitinase đáng kể là các chủng vi khuẩn

thuộc các chi Enterobacter và Streptomyces, các chủng nấm sợi thuộc các chi Asperillus,

Penicillium, và Trichoderma, và một số động vật nguyên sinh.

Những năm gần đây có nhiều công trình nghiên cứu tập trung vào enzyme chitinase do tiềm

năng ứng dụng to lớn của enzyme này trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong thu nhận tế bào trần

(thể nguyên sinh), sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine và N-acetyl glucosamine, sản xuất

thuốc trừ sâu sinh học, ứng dụng trong y học, trong việc kiểm soát nấm kí sinh trên cây

trồng…v.v…

Vì những ứng dụng rộng rãi của chitinase như trên, mục đích đề tài chúng tôi nhằm nghiên

cứu sinh tổng hợp chitinase nhằm thu nhận chế phẩm chitinase từ một số chủng nấm sợi và bước

đầu khảo sát một số ứng dụng của enzyme này. Chúng tôi thực hiện đề tài: Khảo sát khả năng sinh

tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma và

ứng dụng.

Mục tiêu đề tài: Lựa chọn chủng nấm sợi có khả năng tổng hợp chitinase cao, thu nhận chế

phẩm chitinase từ canh trường và bước đầu nghiên cứu một số ứng dụng của chitinase.

Nhiệm vụ của đề tài

- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitinase của một vài chủng nấm sợi thuộc giống

Aspergillus, Trichoderma. Chọn chủng nấm sợi sinh tổng hợp chitinase cao để nghiên cứu tiếp.

- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm sợi đã

chọn và tối ưu hóa bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm.

- Thu nhận chế phẩm chitinase.

- Khảo sát các điều kiện hoạt động tối ưu của chế phẩm chitinase: nhiệt độ, pH, nồng độ cơ

chất, thời gian thủy phân cơ chất.

- Bước đầu thử nghiệm một số ứng dụng của chế phẩm chitinase từ nấm sợi.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu đề tài

Thời gian : từ tháng 8/2009 – 7/2010

Địa điểm : Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh Trường

Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh.

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. HỆ ENZYME CHITINASE TỪ NẤM SỢI

1.1.1. Khái quát về enzyme

1.1.1.1. Cấu trúc [1, 23]

Enzyme là một loại phân tử protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia xúc tác cho các

phản ứng sinh học.

Enzyme có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dalton, được cấu tạo từ các L-acid amin

liên kết nhau bởi liên kết peptid. Bộ phận đặc hiệu tham gia phản ứng gọi là trung tâm hoạt động của

enzyme.

Enzyme gồm hai nhóm: nhóm enzyme một cấu tử gồm những enzyme có thành phần hóa học

duy nhất là protein; nhóm enzyme hai cấu tử gồm những enzyme có hai thành phần: phần protein

thuần gọi là apoenzyme có vai trò xúc tác, phần thứ hai phi protein là coenzyme là những chất hữu

cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác. Ngoài ra có một số kim loại như Zn, Cu, Mn, Fe ...

đóng vai trò liên kết enzyme và cơ chất trong quá trình xúc tác phản ứng, liên kết giữa apoenzyme

và coenzyme, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử.

1.1.1.2. Cơ chế hoạt động [16, 23]

Trung tâm hoạt động của enzyme (E) có cấu trúc không gian tương ứng với cơ chất mà chúng

xúc tác, phản ứng hình thành trong quá trình enzyme tiếp xúc với cơ chất như “chìa khóa-ổ khóa“

tạo phức hợp enzyme-cơ chất. Quá trình tác động của enzyme vào cơ chất để tạo sản phẩm trải qua

ba giai đoạn:

Giai đoạn 1: Enzyme (E) tương tác với cơ chất (S) nhờ những liên kết tạo phức E-S

Giai đoạn 2: Khi cơ chất (S) tạo phức với enzyme (E), cơ chất sẽ bị thay đổi cấu hình không

gian và mức độ bền vững các liên kết, liên kết bị phá vỡ tạo sản phẩm.

Giai đoạn 3: Enzyme tách ra, được giải phóng nguyên vẹn. Sản phẩm (P) tạo thành.

Sơ đồ cơ chế tác động enzyme:

E + S  E-S  E + P

1.1.1.3. Phân loại enzyme [16, 23]

Có nhiều cách phân loại enzyme, ở đây chúng tôi đề cập đến cách phân loại dựa vào kiểu xúc

tác của enzyme. Tại Hội nghị Sinh Hóa học năm 1961 họp tại Moscow đã đề ra một bảng phân loại

mới, trong đó enzyme được chia ra làm 6 lớp chính:

- Oxydoreductase (lớp enzyme oxy hóa hoàn nguyên sinh học)

- Transferase (lớp enzyme vận chuyển)

- Hydrolase (lớp enzyme thủy phân)

- Liase (lớp enzyme phân giải chất không theo con đường thủy phân)

- Ligase hay Synthetase (lớp enzyme tổng hợp chất)

- Isomerase hay Mutase (lớp enzyme đồng phân hóa)

1.1.2. Enzyme chitinase [32]

1.1.2.1. Cấu trúc

Chitinase [Poly- Beta- 1- 4 – (2-acetalmido-2-deoxy) - D-glucoside glucanohydrolase]

thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay

chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N￾acetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Mã số của enzyme chitinase là EC 3.2.1.14.

3 → Hydrolase

2 → Glycosylase

1 → Glycosidase

14 → Chitinase

Chitinase còn có các tên gọi khác (tùy theo xuất xứ enzyme) là chitodextrinase, β-poly-N￾acetyl glucosamine, ChiA1 (Bacillus circulans), Chitotriosidase (Homo sapiens), ChiC

(Streptomyces griceus) ...

Căn cứ vào hệ thống phân loại enzyme, chitinase thuộc ba họ Glycohydrolase 18 và

Glycohydrolase 19 và Glycohydrolase 20.

 Họ Glycohydrolase 18

Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote,

Prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác

như chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase.

Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β

cuộn tròn, chúng hoạt động thông qua một cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β polymer bị

phân cắt tạo ra sản phẩm là β anomer. [32]

Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các giống như Aeromonas

hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia

marcescens…

Hình 1.1. Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 [68]

 Họ Glycohydrolase 19

Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra còn có ở xạ khuẩn

Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng

xoắn và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển.

Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II,IV.

Hình 1.2. Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19 [69]

 Họ Glycohydrolase 20

Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi

khuẩn, Streptomyces và người.

Ngoài ra, dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide

nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm:

Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc

tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết). Vùng giàu

cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt

động xúc tác.

Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu

cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương tự chitinase ở nhóm I.

Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn.

Nhóm III: trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II

Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47% trình tự

amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu

cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I.

Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu

cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao.

1.1.2.2. Cơ chế hoạt động của enzyme chitinase [11]

Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin 1-4-- chitobiosidase, N-acetyl- -

D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase.

Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn

olygosaccharides, đã được nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma

harzianum (2 loại endochitinase: M1 = 36kDa, pI1 = 5,3 (± 0,2) và M2 = 40kDa, pI2 = 3,9),

Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 7,8).

Chitin 1,4- - chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính là các

dimer chitobiose, cụ thể enzyme này được thu từ Trichoderma harzianum (M = 36kDa, pI = 4,4 ±

0,2).

N-acetyl –  - D - glucosaminidase (exochitinase) là enzyme phân cắt chitin từ một đầu cho

sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-glucosamine.

Chitobiase là enzyme phân cắt chitobiose thành hai đơn phân N-acetyl-D-glucosamine.

Hình 1.3. Vị trí phân cắt enzyme chitinase [70]

Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer, sản phẩm tạo

thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các

diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa.