Khảo sát đa dạng di truyền và các chất có hoạt tính sinh học của một số loài thuộc họ Na (Annonaceae) ở khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu-Phước Bửu. :Luận văn thạc sĩ :Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

BỘ CÔNG THƢƠNG

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN NGỌC DUYÊN

KHẢO SÁT ĐA DẠNG DI TRUYỀN

VÀ CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC HỌ NA

(ANNONACEAE) Ở KHU BẢO TỒN

THIÊN NHIÊN BÌNH CHÂU-PHƢỚC BỬU

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã ngành: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

Công trình đƣợc hoàn thành tại Trƣờng Đại học Công nghiệp TP. Hồ Chí Minh.

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Văn Hồng Thiện

Luận văn thạc s đƣợc ảo vệ tại Hội đồng chấm ảo vệ Luận văn thạc s Trƣờng

Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 16 tháng 06 năm 2022

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc s gồm:

1. PGS. TS. Trịnh Ngọc Nam ...........................- Chủ tịch Hội đồng

2. TS. Nguyễn Trần Đông Phƣơng .....................- Phản iện 1

3. TS. Đào Quốc Hƣng .......................................- Phản iện 2

4. TS. Đặng Văn Sơn ..........................................- Ủy viên

5. TS. Nguyễn Thị Lan Hƣơng ...........................- Thƣ ký

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG VIỆN TRƢỞNG VIỆN CNSH&TP

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGUYỄN NGỌC DUYÊN MSHV: 19630121

Ngày, tháng, năm sinh: 25/07/1986 Nơi sinh: TP. Hồ Chí Minh

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 8420201

I. TÊN ĐỀ TÀI:

Khảo sát đa dạng di truyền và các chất có hoạt tính sinh học của một số loài thuộc

họ Na (Annonaceae) ở khu ảo tồn thiên nhiên Bình Châu-Phƣớc Bửu.

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Nhiệm vụ: Hoàn thành luận văn và ảo vệ đúng thời hạn.

Nội dung nghiên cứu của luận văn tốt nghiệp:

- Giải trình tự hai chiều, xây dựng cây phát sinh loài của các loài nghiên cứu.

- Xác định đƣợc thành phần, hoạt tính sinh học, giá trị dƣợc liệu của cao chiết

acetone từ lá các loài nghiên cứu.

II. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Theo Quyết định số 1237/QĐ-ĐHCN ngày 29

tháng 09 năm 2021.

III. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Ngày 29 tháng 03 năm 2022.

IV. NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Văn Hồng Thiện.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2022

NGƢỜI HƢỚNG DẪN

(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký)

VIỆN TRƢỞNG VIỆN CNSH&TP

(Họ tên và chữ ký)

BỘ CÔNG THƢƠNG

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Quý thầy cô của Trƣờng Đại học Công nghiệp Thành

phố Hồ Chí Minh, Viện Đào tạo Quốc tế và Sau đại học đã tạo mọi điều kiện thuận

lợi cho tôi thực hiện luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS.Văn Hồng Thiện - thầy đã luôn tận tình giúp đỡ,

hƣớng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn thạc s

này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các Giáo sƣ, Phó giáo sƣ, Tiến s trong Hội đồng các cấp

đã đọc và góp ý cho luận văn của tôi. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô tại

Viện công nghệ Sinh học và Thực phẩm đã cho tôi nhiều ý kiến quý áu trong quá

trình làm luận văn.

Qua đây, tôi cũng xin ày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến gia đình, ngƣời thân và ạn è

đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này.

Học viên thực hiện

Nguyễn Ngọc Duyên

ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Trong nghiên cứu này, dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử, vùng matK và trnL-F của

mƣời loài thuộc họ Annonaceae thu thập tại Khu ảo tồn thiên nhiên Bình Châu￾Phƣớc Bửu, Việt Nam lần đầu tiên đƣợc khuếch đại và giải trình tự thành công.

Cùng với các trình tự matK và trnL-F của các loài thuộc họ Annonaceae từ cơ sở dữ

liệu GenBank, hệ thống phát sinh loài phân tử của mƣời loài nghiên cứu đƣợc thiết

lập.

Bên cạnh đó, ằng kỹ thuật sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ (GC/MS), nghiên cứu

này cũng lần đầu cho thấy thành phần hóa học của cao chiết acetone ly trích từ lá

của chín loài họ Annonaceae. Kết quả đã xác định đƣợc tổng cộng 182 hợp chất

trong chín loài nghiên cứu. Đáng chú ý, nhiều chất trong các thành phần này đã

đƣợc xác định là có hoạt tính sinh học nhƣ khả năng kháng khuẩn, kháng tế ào ung

thƣ cũng nhƣ kháng oxi hóa hiệu quả.

Ngoài ra, nghiên cứu này cũng lần đầu xác định một số hoạt tính sinh học của cao

chiết acetone của chín loài nghiên cứu. Theo đó, tám trên chín loại cao chiết cho

khả năng kháng lại hai chủng vi khuẩn là Bacillus cereus và Staphylococcus aureus.

Khảo sát hoạt tính gây độc trên dòng tế ào HepG2 ằng phƣơng pháp SRB

(Sulforhodamine B) cho thấy, chín loại cao chiết đều cho khả năng kháng lại dòng

tế ào này, trong đó cao chiết của loài G. touranensis có hoạt tính gây độc mạnh

nhất đối với dòng tế ào HepG2 với giá trị IC50 là 5.39 µg/mL. Hơn nữa, chín loại

cao chiết cũng cho thấy có tiềm năng kháng lại gốc tự do DPPH, trong đó cao chiết

của loài A. hexapetalus cho khả năng kháng mạnh nhất với giá trị IC50 là 18.56

µg/mL.

iii

ABSTRACT

In this study, based on molecular biology techniques, the matK and trnL-F regions

of ten species of the Annonaceae family collected from Binh Chau-Phuoc Buu

Nature Reserve, Vietnam were amplified and analyzed for the first time. Together

with matK and trnL-F sequences of Annonaceae species from the GenBank

database, the molecular phylogenetic system of ten studied species was established.

Besides, by using GC/MS technique, this study also shows for the first time the

chemical compositions of the acetone extracts isolated from the leaves of nine

species of the Annonaceae family. The results of the study identified a total of 182

compounds in the nine species studied. Notably, many of these components have

been identified as having biological effects such as effective antibacterial, anti￾cancer and antioxidant activities.

In addition, this study also determined for the first time some biological activities of

the acetone extracts of nine studied species. Accordingly, eight out of nine extracts

were found to be effective against two bacterial strains, including Bacillus cereus

and Staphylococcus aureus. Investigation of cytotoxic activity on HepG2 cell line

by SRB method (Sulforhodamine B) showed that, nine extracts had an inhibitory

effect on this cell line, in which the G. touranensis extracts possessed the strongest

cytotoxicity with the IC50 value of 5.39 µg/mL. Moreover, nine extracts also showed

antioxidant activities, as evaluated using the DPPH radical scavenging assay, in

which the A. hexapetalus extract was found the highly effective against the DPPH

radical scavenger with the strongest resistance with IC50 value of 18.56 µg/mL.

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của ản thân tôi. Các kết quả nghiên

cứu và các kết luận trong luận văn là trung thực, không sao chép từ ất kỳ một

nguồn nào và dƣới ất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã đƣợc

thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định. Đồng thời, việc

sử dụng các số liệu, kết quả đã đƣợc sự nhất trí cho phép của TS. Văn Hồng Thiện.

Học viên

Nguyễn Ngọc Duyên

v

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ............................................................................ ii

ABSTRACT.............................................................................................................. iii

LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iv

MỤC LỤC...................................................................................................................v

DANH MỤC HÌNH ẢNH ...................................................................................... viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU ...................................................................................... ix

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT......................................................................................x

MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1

1. Đặt vấn đề ...............................................................................................................1

2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................................2

3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu...........................................................................2

4. Ý ngh a thực tiễn của đề tài.....................................................................................3

CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU .............................4

1.1 Tổng quan về khu ảo tồn thiên nhiên Bình Châu-Phƣớc Bửu.....................4

1.2 Tổng quan về họ Na (Annonaceae)...............................................................4

1.3 Nghiên cứu họ Na (Annonaceae) trên thế giới và ở Việt Nam .....................6

1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới .........................................................................6

1.3.1.1 Về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ..................................6

1.3.1.2 Về di truyền......................................................................................7

1.3.2 Nghiên cứu trong nƣớc ...........................................................................8

1.3.2.1 Về thành phần hóa học.....................................................................8

1.3.2.2 Về di truyền......................................................................................8

1.4 Nghiên cứu phát sinh loài ở thực vật ằng chỉ thị phân tử............................9

1.4.1 DNA ribosome nhân (nrDNA) .............................................................10

1.4.2 DNA ty thể (mtDNA) ...........................................................................10

1.4.3 DNA lục lạp (cpDNA)..........................................................................10

1.5 Phƣơng pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS) ................................12

vi

1.5.1 Sắc ký khí (GC) ....................................................................................12

1.5.2 Khối phổ (MS)......................................................................................13

1.5.3 Kỹ thuật sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS).................................14

1.6 Stress oxy hóa và khả năng kháng oxi hóa của các hợp chất sinh học........14

1.7 Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất sinh học ..........................................15

1.8 Cơ chế kháng ung thƣ của các hợp chất sinh học........................................16

CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................18

2.1 Vật liệu, hóa chất dùng trong nghiên cứu....................................................18

2.1.1 Vật liệu..................................................................................................18

2.1.1.1 Mẫu thực vật ..................................................................................18

2.1.1.2 Chủng vi sinh vật ...........................................................................19

2.1.1.3 Dòng tế ào HepG2........................................................................19

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu .................................................19

2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................19

2.2.1 Phƣơng pháp thu thập và tổng hợp dữ liệu...........................................19

2.2.2 Phƣơng pháp thu thập mẫu vật thực vật ...............................................20

2.2.3 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số ..................................................20

2.2.4 Phƣơng pháp PCR khuếch đại các vùng trình tự nghiên cứu ...............21

2.2.5 Phƣơng pháp hiệu chỉnh trình tự và xây dựng cây phát sinh loài ........21

2.2.6 Phƣơng pháp tạo cao acetone ...............................................................22

2.2.7 Phƣơng pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS)................................22

2.2.8 Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn......................................22

2.2.9 Phƣơng pháp kháng oxi hóa .................................................................23

2.2.10 Độc tính tế ào - Thử nghiệm SRB...................................................24

2.2.11 Phƣơng pháp xử lý số liệu.................................................................25

CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.........................................................26

3.1 Kết quả phân loại 10 loài họ Annonaceae nghiên cứu ................................26

3.1.1 Artabotrys hexapetalus (L.f.) Bhandari................................................26

3.1.2 Desmos cochinchinensis Lour. .............................................................27

3.1.3 Goniothalamus touranensis Ast ...........................................................28

3.1.4 Mitrephora thorelii Pierre.....................................................................29

vii

3.1.5 Polyalthia luensis (Pierre) Finet & Gagnep..........................................30

3.1.6 Uvaria grandiflora Wall.......................................................................31

3.1.7 Sphaerocoryne affinis (Teijsm. & Binn.) Ridl......................................32

3.1.8 Uvaria littoralis Blume.........................................................................34

3.1.9 Uvaria micrantha (A.DC.) Hook.f. & Thomson..................................35

3.1.10 Xylopia pierre Hance.........................................................................37

3.2 Kết quả xác định mã vạch DNA cho 10 loài họ Annonaceae thông qua

vùng chỉ thị phân tử...................................................................................................38

3.3 Kết quả xác định thành phần hóa học của cao chiết acetone 9 loài họ

Annonaceae ...............................................................................................................45

3.4 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết acetone 9 loài họ Annonaceae..........48

3.5 Hoạt tính kháng oxi hóa của cao chiết acetone chín 9 họ Annonaceae.......52

3.6 Hoạt tính gây độc tế ào của cao chiết acetone của 9 loài Annonaceae .....53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................57

TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................59

PHỤ LỤC..................................................................................................................76

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN .......................................................108

viii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 3.1 Loài Artabotrys hexapetalus......................................................................27

Hình 3.2 Loài Desmos cochinchinensis ...................................................................28

Hình 3.3 Loài Goniothalamus touranensis...............................................................29

Hình 3.4 Loài Mitrephora thorelii ............................................................................30

Hình 3.5 Loài Polyalthia luensis...............................................................................31

Hình 3.6 Loài Uvaria grandiflora.............................................................................32

Hình 3.7 Loài Sphaerocoryne affinis .......................................................................34

Hình 3.8 Loài Uvaria littoralis .................................................................................35

Hình 3.9 Loài Uvaria micrantha...............................................................................36

Hình 3.10 Loài Xylopia pierrei .................................................................................37

Hình 3.11 Kết quả PCR vùng trình tự trnL-F (A) và matK (B) của 10 mẫu nghiên

cứu. ........................................................................................................38

Hình 3.12 Cây phát sinh loài đƣợc xây dựng dựa trên vùng gen trnL-F ằng phần

mềm PAUP*4.0a146 .............................................................................42

Hình 3.13 Cây phát sinh loài đƣợc xây dựng dựa trên vùng gen matK ằng phần

mềm PAUP*4.0a146 .............................................................................43

Hình 3.14 Cây phát sinh loài đƣợc xây dựng dựa trên sự kết hợp 2 vùng gen trnL-F

và vùng gen matK ằng phần mềm PAUP*4.0a146 .............................44

Hình 3.15 Khả năng kháng khuẩn của cao chiết chín loài họ Annonaceae đối với

chủng B. cereus ở các nồng độ khác nhau.............................................50

Hình 3.16 Khả năng kháng khuẩn của cao chiết chín loài họ Annonaceae đối với

chủng S. aureus ở các nồng độ khác nhau.............................................50

ix

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Thông tin chi tiết về 10 loài nghiên cứu đƣợc thu thập từ Khu ảo tồn

thiên nhiên Bình Châu-Phƣớc Bửu ..........................................................18

Bảng 2.2 Hai cặp mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này......................................21

Bảng 3.1 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết acetone của 9 loài thuộc họ

Annonaceae trong nghiên cứu này ...........................................................51

Bảng 3.2 Các hoạt động chống oxy hóa và gây độc tế ào của cao chiết acetone của

9 loài Annonaceae ....................................................................................56