HPV-PCRELISA-Fulltext-Page pot

Định genotype HPV bằng kỹ thuật PCR – ELISA lai 9 dò genotype 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 và 6/11

Lê Thúy Quyên*(1), Phạm Hùng Vân(2), Võ Đức Xuyên An(3), Lê Thị Phi Yến(3), Hòang Hiếu Ngọc(4)

Tóm tắt

Đặt vấn đề: HPV với các kiểu gen nguy cơ cao như 16, 18 là các tác nhân có tiềm năng sinh ung thư. Tại Việt Nam,

do thiếu phương tiên chẩn đóan nên có rất ít các công trình nghiên cứu về tần suất các kiểu gen HPV phát hiện được

trong các quệt cổ tử cung.

Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng và phát triển kỹ thuật PCR-ELISA lai với 9 dò đặc hiệu kiểu gen là 16, 18, 31, 33,

35, 39/45 và 6/11 để phát hiện và xác định kiểu gen HPV từ các quệt cổ tử cung.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Bệnh phẩm nghiênc ứu là các quệt cổ tử cung. Để phát hiện và xác định

genotype của human papilloma virus, chúng tôi đã xây dựng kỹ thuật PCR – ELISA với nguyên tắc như sau: đầu

tiên khuếch đại 1 đoạn gen đặc hiệu dài 450 bp nằm trên vùng L1 của HPV để tạo ra những sản phẩm khuếch đại.

Những sản phẩm khuếch đại này đều được đánh dấu DIG trong quá trình thực hiện phản ứng PCR. Sau đó thực hiện

biến tính và lai sản phẩm với các đoạn dò đặc hiệu cho từng genotype đã được gắn trên các giếng ELISA. Sản phẩm

lai gắn trên giếng sẽ được phát hiện bằng cộng hợp là anti – DIG gắn HRPO. Phức hợp này sẽ được phát hiện bằng

chất hiện màu TMB.

Kết quả: Tiến hành thử nghiệm PCR-ELISA trên 84 mẫu bệnh phẩm lấy từ cổ tử cung bằng que Ayre hòa trong

dung dịch nước muối sinh lý được bệnh viện Từ Dũ và một số phòng khám phụ khoa khác gửi đến, chúng tôi ghi

nhận có 45 mẫu có DNA – HPV dương tính chiếm tỉ lệ 55%. Đây là một tỉ lệ khá cao so với các nghiên cứu trước

đây của bệnh viện Hùng Vương thực hiện trên các mẫu xét nghiệm bất kỳ. Sản phẩm PCR-ELISA của 45 mẫu này

sau đó được tiếp tục định genotype bằng kỹ thuật ELISA lai với dò đặc hiệu của 9 genotype được phủ sẵn trên giếng

là 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 và 6/11; kết quả ghi nhận được như sau: type 16 chiếm 25 trường hợp (56%), các type

khác chiếm tỷ lệ lần lượt là 18 (4%), 31 (2%), 33 (7%), 35 (2%), 39/45 (2%), 6/11 (16%). Có 7 trường hợp không

phát hiện được genotype, chiếm 16%. Với các kết quả này, các tác giả nhận thấy rằng có một tỉ lệ nhiễm những

genotype HPV khác ngoài 9 type thông thường mà các tác giả đã thiết lập trong thử nghiệm ELISA và tỉ lệ này cũng

không phải là ít.

Kết luận: Từ các kết quả nghiên cứu trên, các tác giả cho là kỹ thuật PCR-ELISA là kỹ thuật thích hợp nhất để có

thể triển khai được tại các phòng thí nghiệm lâm sàng có phương tiện PCR để phát hiện và xác định genotype HPV

trong các bệnh phẩm quệt cổ tử cung

Abstract

Genotyping of HPV by PCR – ELISA hybridized 9 genotype specific probes 16, 18, 31, 33, 35, 39/45 and 6/11

Background: HPV with high risk genotypes as like as 16, and 18 are the potential carcinenous pathogens for

cervical cancer. In Viet Nam, because of the lack of diagnostic tool detecting and genotyping of HPV, there were

still very few studies on the prevalence of HPV genotype detected from cervical swabs.

Aims of the study: Develop the PCR-ELISA hybridized with 9 genotype specific probes 16, 18, 31, 33, 35, 39/45

and 6/11 to detect and genotype HPV from the cervial swabs.

Methods: To detect and identify genotype of HPV, we set PCR – ELISA technique with main principle: First, a 450

bp – DNA HPV in L1 region is amplified by PCR. These PCR product were labelled with DIG in the PCR reaction,

then it will be denatured and hybrided with specific probes which are attached passively to streptavidine in ELISA

wells. Hybrided products will be detected by anti DIG – HRPO conjugate and then detected by TMB.

Results: With 84 samples received from Tu Du hospital and other gynecology clinics, after running PCR reaction,

there are 45 samples positive to DNA – HPV. These 45 PCR products, then, will be genotyped by ELISA method in

which these PCR product will be hybridized with 9 genotypic probes including 16, 18, 31, 33, 35, 39/45, and 6/11.

The collected result revealed that 25 are belong to type 16 (56%), other types 18, 31, 33, 35, 39/45, 6/11 have 4%,

2%, 7%, 2%, 2%, 11%, respectively. There are 7 samples positive to DNA-HPV but cannot identify genotype, have

16%. Authors realize that there is an unexpected incidence of other HPV types besides 9 HPV types that set up in

ELISA.

Conclusions: In Vietnam, PCR-ELISA is the most suitable technique that can be set up in the clinical laboratories

with PCR facilities to detect and genotyping of HPV in the cervical swabs

Đặt vấn đề

Ung thư cổ tử cung là loại ung thư chiếm tỉ lệ

cao nhất hoặc nhì trong các loại ung thư ở cơ quan

sinh dục nữ, chiếm 12% các bệnh ác tính của phụ

nữ. Xuất độ ở châu Âu và Bắc Mỹ là từ 30 đến 35

ca bệnh mới hàng năm, tính trên 100.000 dân. Tại

Việt, Nam, ung thư cổ tử cung chiếm tỉ lệ 38,55%,

đa số gặp ở phụ nữ độ tuổi 40 – 49(1). Kết quả điều

trị tùy thuộc hoàn toàn vào giai đọan phát triển

của ung thư được phát hiện. Nếu phát hiện và điều

1

*Tác giả chính, (1)Thạc Sĩ, BM Sinh Học, Khoa Khoa Học Cơ Bản, Đại Học Y Dược TP. HCM; (2)TS., Bộ Môn Vi Sinh,

Khoa Y, Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh; (3)Cử Nhân Sinh Học, Công ty Nam Khoa Biotek; (4)BS., Bộ Môn Sinh Hóa,

Khoa Y, Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh