hảo sát hợp chất kháng Staphylococcus Aureus kháng Methicillin (MRSA) từ chủng Bacillus SP.RD26 được phân lập từ cây diệp hạ châu đắng (Phyllathus Amarus schum.Et Thonn)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

KHẢO SÁT HỢP CHẤT KHÁNG

STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG

METHICILLIN (MRSA) TỪ CHỦNG BACILLUS

SP.RD26 ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ CÂY DIỆP HẠ

CHÂU ĐẮNG (PHYLLATHUS AMARUS SCHUM.ET

THONN)

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Vương Hạ Quỳnh

Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Văn Minh

TP. Hồ Chí Minh, 2018

I

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................IV

DANH MỤC BIỂU ĐỒ.................................................................................................... V

DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................................ V

DANH MỤC VIẾT TẮT.................................................................................................VI

ĐẶT VẤN ĐỀ ..................................................................................................................... 1

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI:................................................................................................................. 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................... 3

1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG

METHICILLIN (MRSA)..................................................................................................... 4

1.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin ..................................................... 4

1.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh của Staphylococci ........................................................... 6

1.2.1 Đề kháng  - lactams.............................................................................................................................................6

1.2.2 Đề kháng Penicillin................................................................................................................................................7

1.2.3 Đề kháng Methicillin.............................................................................................................................................7

1.2.4 Đề kháng Vancomycin.........................................................................................................................................8

1.3. Tình hình MRSA kháng kháng sinh trên thế giới và Việt Nam................................... 8

2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU........................................................................................ 11

2.1 Sơ lược về cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schunm.et thonn)............... 11

2.2.1 Đặc điểm thực vật học........................................................................................................................................11

2.1.2 Đặc điểm hình thái................................................................................................................................................12

2.1.3 Phân bố.........................................................................................................................................................................12

2.1.4 Công dụng và các bài thuốc đặc trị bệnh từ cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus

amarus Schum. Et Thonn)............................................................................................................................................12

2.2 Vi khuẩn nội sinh......................................................................................................... 13

II

2.3 Vi khuẩn Bacillus ........................................................................................................ 14

2.3.1 Phân loại......................................................................................................................................................................14

2.3.2 Hình dạng và kích thước...................................................................................................................................14

2.3.3 Đặc điểm nuôi cấy ................................................................................................................................................15

2.3.4 Ứng dụng của Bacillus.......................................................................................................................................15

3.PHƯƠNG PHÁP CHIẾT................................................................................................ 16

3.1 KHÁI NIỆM ......................................................................................................................................................16

3.2 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng ........................................................................................... 17

4. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN DỊCH CHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC – MS.......... 18

4.1 Giới thiệu về sắc kí ghép khố phổ ............................................................................... 18

4.2 Đặc điểm...................................................................................................................... 18

4.3 Sắc ký khí .................................................................................................................... 19

4.4 Nguyên tắc hoạt động của sắc ký khí .......................................................................... 19

5. TÌNH HÌNH CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VI KHUẨN KHÁNG VI KHUẨN

KHÁNG THUỐC ..............................................................................................................20

5.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn kháng vi khuẩn kháng thuốc thế giới....................... 20

5.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn kháng vi khuẩn kháng thuốc ở Việt Nam ................. 21

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 23

1. VẬT LIỆU ..................................................................................................................... 24

1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................................... 24

1.2 Chủng vi sinh vật nghiên cứu...................................................................................... 24

1.3 Môi trường – hóa chất ................................................................................................. 24

1.4 Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................................... 24

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................................... 25

2.1 Tái kiểm tra.................................................................................................................. 26

2.1.1 Tái phân lập chủng Bacillus sp. RD26 ....................................................................................................26

2.1.2 Lên men chủng Bacillus sp. RD26 trên môi trường tối ưu.........................................................27

2.1.3 Chuẩn bị thí nghiệm.............................................................................................................................................28

2.1.3.1 Chuẩn bị môi trường.............................................................................................. 28

III

2.1.3.2 Chuẩn bị dịch vi khuẩn MRSA ............................................................................. 28

2.1.3.3 Chuẩn bị dịch vi khuẩn thử nghiệm ...................................................................... 28

2.1.4 Tái kiểm tra hoạt tính kháng MRSA của chủng Bacillus sp.RD26.......................................28

2.1.4.1 Tiến hành thử nghiệm............................................................................................ 28

2.1.4.1 Kết quả................................................................................................................... 29

2.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền dịch lên men của chủng Bacillus

sp.RD26 ............................................................................................................................. 29

2. 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến độ bền dịch lên men của chủng Bacillus sp.RD26.

........................................................................................................................................................................................................29

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của dịch lên men của chủng Bacillus

sp. RD26 thử nghiệm.......................................................................................................................................................30

2.2.2.4 Tiến hành thử nghiệm............................................................................................ 30

2.3 Tách chiết và đánh giá hợp chất kháng khuẩn sau khi thu nhận ................................. 31

2.4 Xác định thành phần hợp chất bằng phương pháp GC - MS. ..................................... 32

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN................................................................. 33

3. KẾT QUẢ ...................................................................................................................... 34

3.1 Tái kiểm tra chủng Bacillus sp. RD26 ........................................................................ 34

3.1.1 Tái kiểm tra................................................................................................................................................................34

3.1.1.1 Tái phân lập chủng Bacillus sp. RD26 .................................................................. 34

........................................................................................................................................................................................................34

........................................................................................................................................................................................................34

3.1.2 Tái kiểm tra hoạt tính kháng bằng phương pháp khếch tán giếng thạch ...........................34

3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến độ bền của hoạt tính kháng khuẩn của

Bacillus sp. RD26.............................................................................................................. 36

3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến dịch lên men kháng khuẩn thu nhận từ

chủng Bacillus sp. RD26 ................................................................................................... 39

3.4 Kết quả tách chiết và đánh giá hợp chất kháng khuẩn sau khi thu nhận..................... 41

3.5 Kết quả xác định thành phần hợp chất kháng khuẩn bằng phương pháp GC – MS. .. 43

3.5.1 Thành phần hóa học trong dịch Methanol.............................................................................................43

3.5.1 Thành phần hóa học trong dịch Ethanol.................................................................................................44

IV

3.6 So sánh thời gian lưu của dịch mẫu có Ethanol và Methanol ..................................... 46

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...................................................................... 48

4.1 KẾT LUẬN..................................................................................................................... 49

4.2 ĐỀ NGHỊ........................................................................................................................ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 51

PHỤ LỤC 1 MÔI TRƯỜNG – HÓA CHẤT .................................................................. 1

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ ............................................................... 3

PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC – MS ............... 5

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả tái phân lập chủng Bacillus sp.RD26 trong môi trường tối ưu .......

……………………………………………………………………………………..34

Bảng 3.2 Kết quả thử khả năng kháng bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch

.................................................................................................................................. 35

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khả năng ảnh hưởng hoạt tính kháng khuẩn đến độ bền

của Bacillus sp.RD26 trong pH.............................................................................. 37

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khả năng ảnh hưởng hoạt tính kháng khuẩn đến độ bền

của Bacillus sp.RD26 trong nhiệt độ .................................................................... 40

Bảng 3.6 Kết quả tách chiết và đánh giá hợp chất kháng khuẩn sau khi thu nhận

................................................................................................................................ 441

Bảng 3.7 Thành phần hóa học trong dịch Methanol ...........................................43

Bảng 3.8 Thành phần hóa học trong dịch Ethanol ..............................................44

Bảng 3.9 Thời gian lưu của mỗi peak....................................................................47

V

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Khả năng ảnh hưởng độ bền hoạt tính kháng khuấn của dịch lên men 31

Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền của dịch kháng khuẩn chủng Bacillus

sp. RD26 ................................................................................................................... 38

Biểu đồ 3.4 Kết quả tách chiết hợp chất kháng khuẩn bằng các dung môi

thử……...…………………………………………………………………..………42

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2. 4 Hình vi thể của MRSA ............................................................................... 4

Hình 1.2 Cơ chế kháng Penicillin và Methicillin của Staphylococcus aureus...........6

Hình 1.2.4 Cơ chế Vancomycin của VISA. Những chủng VISA này tổng hợp thêm

lượng peptidoglycan đồng thời gia tăng D- Ala-D-Ala. Những phần Ala nối với

Vancomycin ngăn không cho tiến đến gần màng tế bào vi khuẩn.............................8

Hình 1.3 Tỷ lệ mà Staphylococcus aureus xâm kháng Methicillin (MRSA) ở 19 quốc

gia và Kosovo (theo Nghị quyết 1244 (1999) của Liên hợp quốc tại CAESAR và 30

quốc gia trong EARS-Net; với các quốc gia thành viên của khu vực Châu Âu qua

mạng lưới giám sát của Trung Á và Đông Âu về mạng lưới kháng kháng sinh năm

2016............................................................................................................................9

Hình 2. 1 Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schunm.et thonn).....................11

Hình 2.3 Hình vi thể của Bacillus ........................................................................... 14

Hình 3. 1 Sự phân bố của một chất tan trong hai pha lỏng ...................................... 17

Hình 4.1 : Sơ đồ hệ thống GC...................................................................................20

Hình 2.5 Kết quả kháng khuẩn của vi khuẩn thử nghiệm ........................................ 29

Hình 3.2 Hình thái đại thể của Bacillus sp. RD26 ở 24 giờ ..................................... 34

Hình 3. 3 Hình thái vi thể của Bacillus sp. RD26 ở 24 giờ (100x) .......................... 34

VI

Hình 3.4 Kết quả thử khả năng kháng MRSA bằng giếng khuếch tán chủng Bacilus

sp. RD26...................................................................................................................36

Hình 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH đến độ bền hoạt tính kháng khuẩn.............

.................................................................................................................................. 39

Hình 3.6 Kết quả tách chiết chất kháng khuẩn bằng dung môi Ethanol và Methanol42

DANH MỤC VIẾT TẮT

MT Môi trường

v/p Vòng/phút

TB Tế bào

nm nanomet

Cs. Cộng sự

Gram (-) Gram âm

Gram (+) Gram dương

MRSA Methicillin resistant Staphylococcus aureus

“Staphylococcus aureus kháng Methicillin”

ICU Intensive care unit

“Đơn vị hồi sức cấp cứu, điều trị tích cực, chăm sóc đặc biệt”

CDDEP Center for disease dynamics, economics & policy

“Trung tâm động dịch bệnh, kinh tế và chính sách”

CLSI Tiêu chuẩn Phòng thí nghiệm và Lâm sàng