Đánh giá khả năng kiểm soát sinh học của các chủng BACILLUS SPP đối với nấm COLLETOTRICHUM SPP gây bệnh thán thư trên giống ớt sừng trâu (Capsicum Annuum)

i

LỜI CẢM ƠN

Chân thành cảm ơn anh Nguyễn Tấn Đức và chị Trần Thùy Trang đã truyền

đạt cho em vốn kiến thức quý báu và kinh nghiệm thực tiễn trong suốt thời gian

thực hiện khóa luận.

Cảm ơn thầy Nguyễn Văn Minh cùng các thầy cô, bạn bè tại trường Đại học

Mở Tp. HCM đã hỗ trợ em để hoàn thành tốt bài báo cáo.

Cảm ơn Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp.HCM đã tạo điều kiện cho em

được thực tập và làm đề tài tại Trung tâm.

Cảm ơn các anh chị trong phòng Công Nghệ Vi Sinh cùng sinh viên các

trường thực tập tại đây luôn nhiệt tình và thân thiện đã giúp đỡ em trong thời gian

thực hiện đề tài.

Nguyễn Thế Bảo

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i

MỤC LỤC.................................................................................................................. ii

DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................iv

DANH MỤC BẢNG...................................................................................................v

DANH MỤC BIỂU ĐỒ.............................................................................................vi

ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1

1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................1

2. Mục tiêu..................................................................................................................2

PHẦN I: TỔNG QUAN .............................................................................................3

1. Bệnh thán thư ........................................................................................................3

2. Các loài nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ................................................3

2.1 Giới thiệu chung về nấm Colletotrichum..............................................................3

2.2 Các giai đoạn xâm nhiễm......................................................................................4

2.3 Điều kiện xâm nhiễm của nấm..............................................................................5

2.4 Vòng đời của nấm .................................................................................................6

3. Các loài nấm gây hại phổ biến ở Việt Nam.........................................................7

4. Các biện pháp phòng trừ....................................................................................13

4.1 Giống kháng bệnh ...............................................................................................14

4.2 Kiểm soát nuôi trồng...........................................................................................14

4.3 Kiểm soát hóa học...............................................................................................15

4.4 Kiểm soát sinh học ..............................................................................................16

5. Chế phẩm sinh học ..............................................................................................16

6. Vi khuẩn Bacillus ................................................................................................16

6.1 Các chủng Bacillus có khả năng đối kháng nấm cao..........................................17

6.2 Các chất kháng nấm của Bacillus .......................................................................20

6.2.1 Enzyme Mycolytic ...........................................................................................20

6.2.2 Enzyme Chitinase.............................................................................................20

6.2.3 Enzyme Cellulase.............................................................................................21

6.2.4 Các chất thuộc Lipopeptide..............................................................................22

6.2.4.1 Iturin..............................................................................................................22

6.2.4.2 Surfactin ........................................................................................................23

6.2.4.3 Fengycin........................................................................................................23

7. Các nghiên cứu khác...........................................................................................24

7.1 Phân tích các bài báo...........................................................................................25

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................31

iii

1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................................32

2. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................32

3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................33

3.1 Phương pháp xác định hiệu quả đối kháng in vitro ............................................33

3.2 Phương pháp lây bệnh nhân tạo và xác định độc lực nấm bệnh in vitro ............34

3.3 Phương pháp đếm bào tử nấm và vi khuẩn.........................................................34

3.3.1 Phương pháp đếm bào tử nấm..........................................................................34

3.3.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc vi khuẩn .............................................................35

3.4 Các thí nghiệm đánh giá khả năng phòng và trị bệnh thán thư của dung dịch

Bacillus trực tiếp trên ớt in vitro ...............................................................................35

3.5 Phương pháp xử lý đất dùng trong thí nghiệm chậu, vại ....................................36

3.6 Bố trí thí nghiệm trong nhà kính.........................................................................37

3.6.1 Cách thực hiện:.................................................................................................37

3.6.2 Đánh giá hiệu quả Bacillus trong điều kiện in vivo.........................................38

3.7 Phương pháp xử lý số liệu...................................................................................39

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .....................................40

1. Đặc điểm đại thể và vi thể của nấm Colletotrichum spp..................................40

2. Tuyển chọn các chủng Bacillus spp. có tính đối kháng mạnh với

Colletotrichum spp. và quan sát đặc điểm đại thể, vi thể.....................................41

3. Đếm bào tử nấm và vi khuẩn .............................................................................42

4. Kết quả đối kháng in vitro ..................................................................................43

5. Chủng bệnh nhân tạo trên ớt.............................................................................49

6. Các thí nghiệm trên ớt........................................................................................49

6.1 Đánh giá độc lực nấm bệnh.................................................................................49

6.2 Đánh giá khả năng phòng bệnh...........................................................................51

6.3 Đánh giá khả năng trị bệnh .................................................................................53

7. Kết quả trồng ớt trong nhà kính........................................................................55

7.1 Cây ớt ..................................................................................................................55

7.2 Bệnh thán thư trên ớt...........................................................................................56

8. Kết quả đánh giá khả năng kiểm soát sinh học trong nhà kính .....................56

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.......................................................................................61

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................62

PHỤ LỤC .................................................................................................................67

iv

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Giai đoạn sinh trưởng và phát triển của nấm................................................7

Hình 2: Vị trí phân cắt enzyme chitinase ....................................................................21

Hình 3 : Mô tả thí nghiệm đối kháng in vitro. ............................................................33

Hình 4: Cách thức chủng bệnh nhân tạo ....................................................................34

Hình 5 : Các giai đoạn sinh trưởng của ớt trong nhà kính......................................55

Hình 6: Các giai đoạn thán thư trên ớt........................................................................56

Hình 7. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc nấm Colletotrichum accutatum theo thời

gian .....................................................................................................................................40

Hình 8: Đặc điểm vi thể của nấm Colletotrichum accutatum theo thời gian........41

Hình 9: Khả năng đối kháng nấm Colletotrichum spp. của Bacillus spp. và đối

chứng lần 1........................................................................................................................44

Hình 10: Khả năng đối kháng nấm Colletotrichum spp. của Bacillus spp. và đối

chứng lần 2........................................................................................................................46

Hình 11: Khả năng đối kháng nấm Colletotrichum spp. của Bacillus spp. và đối

chứng lần 3........................................................................................................................48

Hình 12 : Kết quả chủng bệnh nhân tạo với đối chứng sau 10 ngày .....................49

Hình 13: Kết quả phương pháp tiêm và tạo vết thương sau 7 ngày........................50

Hình 14 : Thí nghiệm đánh giá khả năng phòng bệnh thán thư của Bacillus spp.

.............................................................................................................................................53

Hình 15 : Tạo hỗn hợp 5 chủng Bacillus spp. ............................................................53

Hình 16 : Kết quả đối kháng trên ớt ở các nồng độ ...................................................55

Hình 17 : Cách chủng bệnh cho cây ớt........................................................................57

Hình 18: những quả bệnh không lây lan sang những quả khác. ...........................58

Hình 19: Các nghiệm thức có phun Bacillus so với đối chứng ...............................60

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 : Một số loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh trên ớt theo quốc gia. .....4

Bảng 2: Đặc điểm những loài nấm Colletotrichum spp. chính gây bệnh thán thư

ở Việt Nam...........................................................................................................................7

Bảng 3: Các chủng vi khuẩn Bacillus spp. đối kháng nấm Colletotrichum spp...17

Bảng 4: Các thành phần iturin khác nhau .................................................................22

Bảng 5: Các nghiên cứu liên quan trong những năm gần đây ...............................24

Bảng 6: Khả năng kháng nấm của Protein trong các điều kiện nhiệt độ..............26

Bảng 7: Đường kính tăng trưởng khuẩn lạc của C. gloeosporioides.....................26

Bảng 8: Hiệu quả kiểm soát sinh học: .........................................................................29

Bảng 9: Đặc điểm đại thể và vi thể của một số chủng Bacillus spp. .......................41

Bảng 10: Kết quả đối kháng in vitro lần 1...................................................................43

Bảng 11: Kết quả đối kháng in vitro lần 2...................................................................44

Bảng 12: Kết quả đối kháng in vitro lần 3...................................................................46

Bảng 13: Tổng số quả và số quả bệnh trong nhà kính..............................................57

vi

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 1: Kết quả đối kháng lần 1...............................................................................44

Biểu đồ 2: Kết quả đối kháng lần 2...............................................................................45

Biểu đồ 3: Kết quả đối kháng lần 3...............................................................................48

Biểu đồ 4: Kết quả chủng bệnh sau 10 ngày ...............................................................49

Biểu đồ 5: Đường kính vết bệnh giữa tiêm và tạo vết thương..................................50

Biểu đồ 6: Trung bình đường kính vết bệnh ở các nghiệm thức.............................51

Biểu đồ 7: Kết quả đối kháng, D là đường kính vết bệnh, L là chiều dài quả ớt..54

Biểu đồ 8: Tỷ lệ bệnh sau 7 ngày, 14 ngày ..................................................................58

Biểu đồ 9: Chỉ số bệnh sau 7 ngày, 14 ngày................................................................58

Biểu đồ 10: tỷ lệ bệnh và tỷ lệ đối kháng sau 7 ngày, 14 ngày. ................................59

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

1. Tính cấp thiết của đề tài

Cây ớt (Capsicum sp.) thuộc chi Capsicum, họ cà (Solanaceae). Có hai nhóm

ớt phổ biến là ớt cay (Capsicum frutescens L.) và ớt ngọt (Capsicum annuum L.).

Trong số các cây trồng thuộc họ cà (Solanaceae), cây ớt có tầm quan trọng thứ hai

chỉ sau cây cà chua. Tổng sản lượng trồng ớt và lượng ớt bột trên thế giới năm 2013

đạt 3.458.634 tấn với diện tích 1.974.910 ha, cũng trong năm đó tính riêng ở Việt

Nam ước tính khoảng 93.000 tấn trên cả nước với tổng diện tích khoảng 64.000 ha

theo thông tin từ FAO [19]. Qua đó nhận thấy được tầm quan trọng của ớt đối với

kinh tế của Việt Nam và trên thế giới.

Có rất nhiều tác nhân gây bệnh làm ảnh hưởng đến thu nhập của người dân

trồng ớt như các bệnh do nấm, vi khuẩn, virus hoặc do côn trùng như sâu, bọ trĩ, rệp,

nhện. Trong đó, nghiêm trọng nhất vẫn là bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp.

gây ra, kế đó là bệnh héo xanh do vi khuẩn Pseudomonas solanacearum, bệnh khảm

virus trên gân lá (CVMV) và bệnh khảm virus dưa chuột (CMV)[25].

Đối với bệnh thán thư, cây bị bệnh kém phát triển, lá vàng và rụng sớm. Bệnh

tấn công trên trái làm thối trái hàng loạt, đôi khi thất thu năng suất 100%. Điều kiện

thời tiết nóng, mưa nhiều, ẩm độ cao (từ 70-80%) thích hợp cho nấm phát triển. Bào

tử nấm bệnh phát tán nhờ gió, mưa và côn trùng. Bào tử nấm bệnh trong thời gian dài

ngừng hoạt động đến khi quả chín sẽ phát bệnh. Nếu trên giống nhiễm, bệnh gây hại

cả trái non.

Các biện pháp để phòng bệnh thán thư được khuyên dùng như: thu gom, tiêu

hủy trái bệnh, sử dụng giống khỏe sạch bệnh, luân canh cây trồng khác họ,.. đều mang

lại hiệu quả nhưng không triệt để. Bệnh vẫn có thể tích tụ trong đất và bùng phát. Sử

dụng thuốc hóa học để trị bệnh tuy đem lại hiệu quả cao nhưng làm ảnh hưởng đến

môi trường, dễ làm nấm bệnh lờn thuốc và ảnh hưởng đến chất lượng quả ớt. Hiện

nay, sử dụng biện pháp sinh học để kiểm soát nấm bệnh đang là ưu tiên hàng đầu, vì

các lợi ích về môi trường sinh thái và an toàn cho người tiêu dùng.

Nhiều tác nhân kiểm soát sinh học được sử dụng để ức chế nấm Colletotrichum

sp. như: nấm Trichoderma, Gliocladium, vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus

lichenifomis, Bacillus amyloliquefaciens, xạ khuẩn Streptomyces. Nhưng trong đó

Bacillus thể hiện là tác nhân kiểm soát sinh học nấm Colletotrichum đã được chứng

minh như hình thành khuẩn lạc hiệu quả ở vùng rễ, hoạt động linh hoạt để chống lại

nhiều tác nhân gây bệnh và khả năng sinh bào tử. Ngoài ra Bacillus còn tiết ra một số

enzyme và các chất có hoạt tính ức chế nấm hữu hiệu.

2

Do vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Đánh giá khả năng kiểm soát sinh học

của một số chủng vi khuẩn Bacillus spp. đối với nấm Colletotrichum spp. gây bệnh

thán thư trên giống ớt sừng trâu (Capsicum annuum).” để làm cơ sở hình thành chế

phẩm vi sinh phòng và trị bệnh thán thư trên cây ớt.

2. Mục tiêu

Xác định khả năng đối kháng sinh học của các chủng Bacillus (B. subtilis, B.

amyloliquefacients, B. licheniformis) đối với nấm Colletotrichum spp. ở 3 cấp độ :

 Đối kháng in vitro trên đĩa petri

 Đối kháng in vivo trên quả ớt

 Đối kháng in vivo trên cây ớt trong nhà kính