Đánh giá đa dạng di truyền và nhân giống trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

======

NGUYỄN THỊ HƯỜNG

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ NHÂN GIỐNG

TRÀ HOA VÀNG TAM ĐẢO (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda)

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

======

NGUYỄN THỊ HƯỜNG

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ NHÂN GIỐNG

TRÀ HOA VÀNG TAM ĐẢO (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda)

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã ngành: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Việt

Hà Nội - 2017

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa

học của TS. Nguyễn Văn Việt. Các nội dung nghiên cứu, kết quả nghiên cứu trong đề

tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào.

Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài liệu của

tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ.

Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung

luận văn.

Học viên

Nguyễn Thị Hường

ii

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới Phòng Đào tạo, Viện Sinh thái và Tài

nguyên sinh vật, Viện Hàm lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã trang bị kiến

thức cho tôi trong xuất quá trình học tập.

Đặc biệt tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới TS. Nguyễn Văn Việt, Viện Công

nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam đã tận tình chỉ bảo

và hướng dẫn tôi trong xuất quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh Luận văn Thạc

sỹ này.

Tôi xin cám ơn các cán bộ Bộ môn Công nghệ tế bào và toàn thể cán bộ Viện

Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi

hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này. Xin cám ơn Ban quản lý Vườn quốc gia Tam

Đảo đã cho phép thu thập mẫu vật làm nguồn vật liệu cho đề tài.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cám ơn gia đình, bạn bè và đông nghiệp đã luôn

sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong xuất quá trình học tập

và nghiên cứu.

Xin chân thành cám ơn !

Hà nội, ngày tháng năm

Học viên

Nguyễn Thị Hường

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN............................................................................................................ i

LỜI CÁM ƠN................................................................................................................. ii

MỤC LỤC..................................................................................................................... iii

DANH MỤC CÁC HÌNH ...............................................................................................v

DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................ vi

ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.................................................3

1.1.Giới thiệu về Trà hoa vàng Tam Đảo.....................................................................3

1.1.1.Hệ thống phân loại và phân bố ........................................................................3

1.1.2.Đặc điểm sinh học Trà hoa vàng Tam Đảo .....................................................3

1.1.3.Giá trị sử dụng cây trà hoa vàng......................................................................4

1.2.Phân tích di truyền bằng kỹ thật RAPD–PCR .......................................................6

1.2.1.Kỹ thuật chỉ thị phân tử trong cải tiến di truyền Camellia...............................6

1.2.2.Kỹ thật RAPD..................................................................................................7

1.2.3.Vị trí và tầm quan trọng của đa dạng di truyền .............................................10

1.3.Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật .......................................................11

1.3.1.Khái niệm nuôi cấy in vitro ...........................................................................11

1.3.2.Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào......................................12

1.3.3.Ý nghĩa của nhân giống in vitro ....................................................................12

1.3.4.Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy...............................................................14

1.4.Các công trình nghiên cứu về chi Camellia.........................................................20

1.4.1.Các công trình nghiên cứu về chi Camellia trên thế giới..............................20

1.4.2.Các công trình nghiên cứu về chi Camellia ở Việt Nam...............................22

CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........26

2.1.Mục tiêu nghiên cứu.............................................................................................26

2.2.Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................26

2.3.Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................................27

2.4.Nội dung nghiên cứu............................................................................................27

2.4.1.Phân tích đa hình ADN loài Trà hoa vàng Tam Đảo bằng kỹ thuật RAPD..27

iv

2.4.2.Xây dựng quy trình nhân giống trà hoa vàng bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

................................................................................................................................27

2.5.Phương pháp nghiên cứu......................................................................................28

2.5.1.Phân tích đa hình ADN loài Trà hoa vàng Tam Đảo.....................................28

2.5.2.Xây dựng quy trình nhân giống Trà hoa vàng Tam Đảo .................................31

2.6.Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu ...................................................33

2.6.1.Chỉ tiêu theo dõi.............................................................................................33

2.6.2.Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................35

3.1.Kết quả phân tích đa hình ADN loài Trà hoa vàng Tam đảo ..............................35

3.1.1.Tách chiết ADN tổng số ................................................................................35

3.1.2.Khuếch đại PCR với 15 mồi RAPD ..............................................................36

3.1.3.Tương quan di truyền của 10 hệ gen nghiên cứu ..........................................37

3.2.Kết quả nhân giống in vitro Trà hoa vàng ...........................................................40

3.2.1.Kết quả khử trùng tạo mẫu sạch và tái sinhh chồi.........................................40

3.2.2.Kết quả tạo cụm chồi và nhân nhanh chồi.....................................................44

3.2.3.Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh. ............................................................53

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................56

4.1. Kết luận ...............................................................................................................56

4.1.1. Kết quả phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD.................................56

4.1.2. Kết quả nhân giống Trà hoa vàng Tam Đảo bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

................................................................................................................................56

4.2. Kiến nghị.............................................................................................................57

TÀI LIỆU THAM KHẢO

v

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cây Trà hoa vàng Tam Đảo.............................................................................3

Hình 3.1. Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agarose 1% .......................................35

Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm khuyếch đại từ mồi CP1 và mồi CP9 trên gel agarose

1,2%...............................................................................................................................37

Hình 3.3. Biểu đồ mô tả quan hệ di truyền của 10 mẫu trà hoa vàng. ..........................39

Hình 3.4. Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ tạo mẫu sạch và tái sinh

chồi ................................................................................................................................41

Hình 3.5. Một số hình ảnh tái sinh trà hoa vàng từ phôi hạt .........................................42

Hình 3.6. Hạt chè nảy mầm trên môi trường WPM ......................................................43

Hình 3.7. Chồi Trà hoa vàng Tam Đảo tái sinh trên môi trường WPM........................46

Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro.........48

Hình 3.9. Ảnh hưởng của loại và hàm lượng đường đến nuôi cấy in vitro Trà hoa vàng ...50

Hình 3.10. Cụm chồi trà hoa vàng phát triển trên môi trường MT7..............................52

Hình 3.11. Biểu đồ ảnh hưởng tổ hợp nồng độ IBA và NAA đến khả năng ra rễ in

vitro................................................................................................................................54

Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA đến khả năng ra rễ in vitro.............55

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi sử dụng........................................................................26

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng dùng cho mỗi phản ứng RAPD - PCR......................29

Bảng 2.3. Chương trình chạy của phản ứng PCR .........................................................30

Bảng 3.1. Nồng độ và độ tinh sạch các mẫu ADN tổng số (pha loãng 10 lần).............36

Bảng 3.2. Phân đoạn RAPD đa hình thu được từ 15 mồi RAPD..................................36

Bảng 3.3. Hệ số tương đồng di truyền Jaccard..............................................................38

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ tạo mẫu sạch và tái sinh chồi.......40

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng tới khả năng nảy mầm.........................43

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng nhân nhanh chồi............44

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi .....................47

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của loại và hàm lượng đường đến khả năng nhân nhanh chồi..49

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ BAP và kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi ....51

Bảng 3.10. Ảnh hưởng tổ hợp nồng độ IBA và NAA đến khả năng ra rễ in vitro .......53