Công nghệ chuyển gen - Chương 1

Chương 1

Các vector sử dụng trong công nghệ

chuyển gen ở động vật và thực vật

I. Vector

Trong sinh học, vector là một phân tử DNA có khả năng mang

một đoạn DNA ngoại lai và khi xâm nhập vào loại tế bào chủ thích

hợp thì có khả năng tự tái bản không phụ thuộc vào sự sao chép của

hệ gen tế bào chủ.

Nói cách khác, vector là một phương tiện truyền thông tin di

truyền trong cơ thể hoặc giữa các cơ thể khác nhau.

Tế bào chủ thường được sử dụng là vi khuẩn E.coli. Phần lớn

các vector là các phân tử DNA dạng vòng nhỏ (plasmid) hoặc là

bacteriophage.

Vector có thể được cắt ở một vị trí xác định bằng một enzym

hạn chế và được nối với một đoạn DNA tương hợp khác được cắt

bởi cùng enzym.

Trong tạo dòng phân tử, vector là rất cần thiết bởi vì thực tế

cho thấy rằng một đoạn DNA chứa gen không thể làm gì trong tế

bào chủ. Vì nó không phải là một bộ phận của genome bình thường

của tế bào, cho nên nó sẽ không được tái bản khi tế bào phân chia,

không được biểu hiện và có khả năng bị phân huỷ khá nhanh.

Trong kỹ thuật di truyền, vector là công cụ có khả năng nghiên

cứu genome người và genome các loài khác và sự sử dụng chúng

trong nghiên cứu đang trở nên ngày càng phổ biến một cách rộng rãi.

II. Các đặc tính của vector

- Vector phải đủ lớn để mang DNA ngoại lai nhưng không quá

lớn.

- Vector phải chứa các trình tự kiểm soát (control sequences)

như khởi điểm tái bản (origin of replication), promoter.

1

- Vector phải mang một hoặc nhiều vị trí nhận biết của enzym

hạn chế.

- Vector phải mang các gen marker chọn lọc (thường là các gen

kháng chất kháng sinh). Vì vậy các tế bào chứa chúng có thể được

phát hiện một cách dễ dàng.

III. Các bước trong tạo dòng phân tử

- Nối vector và đoạn DNA ngoại lai cần được tạo dòng trong

ống nghiệm để tạo DNA tái tổ hợp nhờ sự xúc tác của enzym ligase.

- Biến nạp DNA tái tổ hợp vào một dòng tế bào chủ. Chọn lọc

thể biến nạp trên môi trường agar trong đĩa petri có chất kháng sinh.

- Tách dòng DNA tái tổ hợp bằng cách sử dụng mẫu dò

(probe).

IV. Các vector sử dụng để chuyển gen ở động vật và thực

vật

1. Các vector sử dụng để chuyển gen ở động vật

1.1. Vector sử dụng để thêm gen

Phần lớn các vector sử dụng hiện nay để tạo động vật chuyển

gen bằng cách thêm gen được xây dựng để được hợp nhất vào

genome. Các phương pháp đang được sử dụng hoặc nghiên cứu để

tăng tần số hợp nhất của gen ngoại lai hoặc duy trì chúng như là các

nhiễm sắc thể nhỏ độc lập.

1.1.1. Vector thẳng tối thiểu (Minimum linear vectors)

Ở đại đa số trường hợp, các nhà nghiên cứu sử dụng các đoạn

genome chứa một hoặc hai gen hay chuẩn bị các cấu trúc gen hoạt

động chức năng từ các yếu tố khác nhau. Các đoạn của vector chứa

các vùng phiên mã và điều hòa từ plasmid. Thực vậy, các vector

vòng hợp nhất với tần số thấp hơn nhiều so với các đoạn DNA thẳng

và trình tự plasmid thường phá hủy các gen chuyển đã liên kết. Ðiều

này đúng đối với các vector khác nhau như plasmid, cosmid, phage,

BAC và YAC. Tuy nhiên một số nghiên cứu cho thấy rằng vector

BAC vòng hợp nhất vào genome với hiệu quả giống như bản sao

mạch thẳng của chúng. Nói cách khác, các vector mang các đoạn

2

Hình 1.1: : Tạo dòng bằng vector plasmid

3

DNA genome dài ít nhạy với hiệu quả câm của các trình tự của

prokaryote. Ðiều này là thích hợp nhất nhờ sự hiện diện của các yếu

tố cách ly ở các đoạn genome dài hoặc nhờ một hiệu quả khoảng

cách đơn giản.

Các đoạn DNA không chứa các trình tự đặc biệt hợp nhất vào

genome với tần số tương đối thấp. Một số DNA xen vào tạo ra số

động vật chuyển gen nhiều hơn so với các DNA khác. Ðiều này có

thể xuất hiện từ sự có mặt của các trình tự trong đoạn xen mà nhận

biết thường xuyên các trình tự genome (Hình 1). Một số các đoạn

xen vào có thể chứa các trình tự ưu tiên cho sự phiên mã của chúng

và sự duy trì của chúng trong phôi, tăng cường sự hợp nhất xảy ra.

1.1.2. Vector chứa các trình tự lặp lại

Cơ chế của sự hợp nhất được mô tả ở hình 1 bao hàm sự nhận

biết giữa các trình tự của đoạn xen và của genome. Tần số của sự

hợp nhất được tăng lên nhờ sự có mặt ở cả hai đầu của các đoạn xen

các trình tự lặp lại cao trong genome chủ ngay cả khi chúng bị thoái

hóa nhiều hoặc ít. Ở bò, một trình tự có mặt nhiều ở tâm động làm

tăng thêm các đoạn xen đã tăng tần số hợp nhất. Ở trường hợp đặc

biệt này, các gen chuyển vẫn không hoạt động. Ðiều này là do tâm

động là vùng không phiên mã của genome phá hủy gen chuyển.

Một phương pháp tương tự đã được tiến hành ở chuột, sử

dụng các trình tự Alu. Các trình tự này là các yếu tố lặp lại. Các trình

tự Alu chứa 200-300 nucleotid là có nhiều trong genome động vật có

vú và đặc biệt là ở các vùng lân cận hoặc ở trong các vùng phiên mã.

Một số trình tự Alu được phiên mã bởi RNA polymerase III, làm cho

chức năng của RNA không rõ ràng và có thể không tồn tại. Các thí

nghiệm đã cho thấy rằng tần số hợp nhất được tăng lên đối với các

đoạn xen chứa trình tự Alu.

1.1.3. Vector transposon

Transposonlà một đoạn DNA có khả năng tự tái bản một cách

độc lập và xen vào một vị trí mới trong cùng nhiễm sắc thể hoặc một

nhiễm sắc thể khác (Hình 1.2). Với tiến bộ của kỹ thuật di truyền

transposonđã được sửa đổi, thiết kế thành các công cụ di truyền với

mục đích đặc biệt.

4