Cơ sở và phương pháp sinh học phân tử

TS. CHU HOÀNG MẬU

CƠ SỞ VÀ PHƯƠNG PHÁP

SINH HỌC PHÂN TỬ

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

Lời nói đầu.................................................................................................................................4

Chương 1: HỆ GENE..............................................................................................................5

§1. KHÁI NIỆM HỆ GENE (GENOME)..................................................................5

§2. AXIT NUCLEIC ..................................................................................................9

§3. ADN VÀ TÁI BẢN ADN..................................................................................11

§4. ARN VÀ CƠ CHẾ PHIÊN MÃ .........................................................................19

THẢO LUẬN...........................................................................................................23

Chương 2: ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GENE CỦA SINH VẬT PROKARYOT VÀ

EUKARYOT...........................................................................................................25

§1. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GENE Ở PROKARYOT ..........................................25

§2. CẤU TRÚC PHÂN ĐOẠN GENE Ở EUKARYOT.........................................25

§3. MỘT SỐ TRÌNH TỰ ADN................................................................................27

THẢO LUẬN...........................................................................................................32

Chương 3: MỐI LIÊN HỆ GIỮA ADN, ARN, PROTEIN................................................33

§1. THÔNG TIN DI TRUYỀN VÀ MẬT MÃ DI TRUYỀN .................................33

§2. PROTEIN ...........................................................................................................39

§3. QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP PROTEIN.....................................................42

§4. ĐIỀU HOÀ BIỂU HIỆN GENE ........................................................................45

THẢO LUẬN......................................................................................................................49

Chương 4: ENZYME SỬ DỤNG TRONG KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ............50

§1. ENYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME HOẶC ENZYME CẮT HẠN

CHẾ (RESTRICTION ENDONUCLEASE - RE).............................................50

§2. CÁC NHÓM ENZYME KHÁC.........................................................................57

§3. ENZYME NUCLEASE......................................................................................60

THẢO LUẬN......................................................................................................................61

Chương 5: XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA PROTEIN VÀ ĐẶC TÍNH Ở

SINH VẬT...............................................................................................................62

§1. MỘT SỐ LOẠI PROTEIN CHỨC NĂNG........................................................62

§2. QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ PROTEIN..............................66

§3. KĨ THUẬT PHÂN TÍCH PROTEIN .................................................................67

§4. KĨ THUẬT PHÂN TÍCH ENZYME..................................................................74

§5. NGHIÊN CỨU RIPS BẰNG WESTERN BLOT..............................................77

THẢO LUẬN......................................................................................................................78

Chương 6: KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍCH HỆ GENE SINH

VẬT..........................................................................................................................79

§1. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ADN..............................................................79

§2. LAI PHÂN TỬ...................................................................................................83

§3. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA ADN ..........................................85

§4. RFLP TECHNOLOGY (Kĩ thuật phân tích hiện tượng đa hình của độ dài các

phân đoạn ADN).................................................................................................87

2

THẢO LUẬN......................................................................................................................91

Chương 7: PHẢN ỨNG CHUỖI POLIMERASE (POLIMERASE CHAIN

REACTION - PCR)................................................................................................92

§1. PHẢN ỨNG CHUỖI POLIMERASE (PCR) ....................................................92

§2. PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CỦA ADN ĐƯỢC NHÂN BẢN NGẪU

NHIÊN (RANDQM AMPLIFIED PQLIMORPHIC DAN - RAPD) ................99

§4. PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CHIỀU DÀI CÁC PHÂN ĐOẠN ADN ĐƯỢC

NHÂN BẢN CÓ CHỌN LỌC .........................................................................106

THẢO LUẬN.........................................................................................................108

Chương 8: TẾ BÀO CHỦ VÀ VECTOR ..........................................................................109

§1. TẾ BÀO CHỦ ..................................................................................................109

§2. VECTOR..........................................................................................................111

§3. PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN VECTOR TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ..122

THẢO LUẬN.........................................................................................................125

Chương 9: PHÂN LẬP GENE TÁCH DÒNG PHÂN TỬ VÀ BIỂU HIỆN GENE......126

§1. PHÂN LẬP GENE...........................................................................................126

§2. TÁCH DÒNG GENE.......................................................................................127

§3. BIỂU HIỆN GENE...........................................................................................139

THẢO LUẬN.........................................................................................................151

Tài liệu tham khảo chính .....................................................................................152

những công trình của tác giả cùng các cộng tác viên đã công bố.....................155

CƠ SỞ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ .....................................................162

3

Lời nói đầu

Sinh học phân tử hiện đại đang phát triển mạnh và đã trở thành nòng cốt

của Công nghệ sinh học. Ở Việt Nam, thành tựu nghiên cứu Sinh học phân tử và

áp dụng kĩ thuật phân tử trong nghiên cứu Khoa học sự sốngvà Công nghệ sinh

học đã có nhiều đóng góg trong việc chăm sóc, bảo vệ sức khoẻ con người;

trong đánh giá tài nguyên sinh vật; trong chọn giống và sản xuất nông lâm ngư

nghiệp.

Sinh học phân tử là môn Sinh học hiện đại, được giảng dạy ở nhiều

trường đại học và đang có những đóng góp nhất định trong đào tạo lớp người có

tri thức về Công nghệ sinh học góp phần vào sự nghiệp Công nghiệp hoá, hiện

đại hoá Cơ sở và phương pháp Sinh học phân tử được biên soạn từ nhiều tài

liệu, bài giảng và công trình nghiêm cứu mới về Sinh học phân tử hiện đại của

các tác giả trong và ngoài nước, nhằm cung cấp những kiến thức cơ bản về

nguyên lí và ứng dụng của Sinh học phân tử, làm tài liệu cho nghiên cứu, giảng

dạy và học tập môn này ở trường đại học.

Cuốn Cơ sở và phương pháp Sinh học phân tử được cấu trúc bởi 9

chương:

Chương 1. Hệ gene

Chương 2. Đặc điểm cấu trúc gene của sinh vật Prokaryot và Eukryot

Chương 3. Mối liên hệ giữa ADN, ARN, Protein

Chương 4. Enzyme sử dụng trong kĩ thuật sinh học phân tử

Chương 5. Xác định mối liên quan giữa protein và đặc tính ở sinh vật

Chương 6. Kĩ thuật sinh học phân tử trong tích hệ gene ở sinh vật

Chương 7. Phản ứng chuỗi polimerase (PCR)

Chương 8. Tế bào chủ và Vector

Chương 9. Phân lập gene, tách dòng phân tử và biểu hiện gene.

Tác giả trân trọng cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Trọng Lạng, TS. Lương Thị

Hồng Vân đã đọc và góp ý cho bản thảo, xin cảm ơn những đóng góp của Hội

đồng nghiệm thu đánh giá giáo trình của trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái

Nguyên và cảm ơn các ý kiến đóng góp quý báu của đông đảo các nhà khoa học.

Trong quá trình biên soạn chắc chắn có những sai sót, tác giả rất mong

nhận được những góp ý của bạn đọc. Mọi đóng góp xin gửi về Khoa Sinh - Kĩ

thuật Nông nghiệp trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.

Tác giả

4

Chương 1: HỆ GENE

Tóm tắt: Sự ra đời của sinh học phân tử được đánh dấu bằng thời điểm mà

Oatsơn và Cric (1953) phát hiện ra cấu trúc ADN. Trải qua hơn 40 năm (1953 -

2000) sinh học phân tử đã đạt được những thành tựu vĩ đại mà đỉnh cao của sự

phát triển này là những khám phá bản chất sinh học của sự sống ở cấp độ phân

tử và xây dựng các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng váo thực tiễn. Geneomics

và Proteomics là vấn đề đang được đặc biệt quan tâm hiện nay mà cơ sở của

các lĩnh vực này là những phát hiện về cấu trúc và chức năng của axit nucleic,

về đặc điểm của genome nhân, genome ti thể, genome lạp thể. Những điểm khác

nhau về cấu trúc và chức năng của các hệ gene cho phép ứng dụng vào thực tế

chọn giống và nghiên cứu ở người. Cùng với cấu trúc ADN và ARN còn có đặc

điểm của quá trình tái bản ADN và phiên mã cũng được quan tâm, vì nó là cơ sở

của những kĩ thuật sinh học phân tử - các thao tác ở ADN và ARN. Nội dung cơ

bản của chương đề cập đến những cơ sở của sinh học phân tử.

Nội dung của chương gồm 4 vấn đề cơ bản: (1). Khái niệm hệ gene; (2). Axit

nucleic; (3). ADN vá tái bản ADN, (4). ARN và cơ chế phân mã.

§1. KHÁI NIỆM HỆ GENE (GENOME)

Quá trình sinh trưởng và phát triển của sinh vật trải qua rất nhiều giai

đoạn và tất cả quá trình đó đều phụ thuộc vào sự điều khiển của các gene. Cấu

trúc, chức năng của tế bào được quyết định trực tiếp bởi protein, đó là sản phẩm

cuối cùng của sự biểu hiện gene. Quá trình thể hiện hoạt động của gene qua

protein, bị ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố ngoại cảnh như ánh sáng, chế độ

dinh dưỡng, sự cộng sinh và sự tương tác của các gene trong hệ gene của tế bào.

Như vậy, giữa các thành phần của hệ gene trong tế bào sống có sự tương tác với

nhau và có mối quan hệ với các yếu tố của môi trường. Trong tế bào, bên cạnh

genome trong nhân, hệ thống di truyền còn phân bố trong lục lạp, ti thể và

plasmid (vi khuẩn). Các cơ quan tử này cùng tham gia vào quá trình sinh tổng

hợp protein của tế bào. Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của các cơ

thể sống, tế bào còn là đơn vị của sự di truyền.

Hệ gene là toàn hộ các gene trong tế bào của cơ thể sinh vật, hệ gene hứa

toàn bộ thông tin di truyền đặc trưng cho từng loài, cho từng cá thể trong loài. Ở

sinh vật Prokaryot hệ gene gồm toàn bộ các gene trong tế bào; còn ở Eukaryot

5

hệ gene gồm toàn bộ các gene trong tế bào đơn bội (n). Tế bào đơn bội có một

hệ gene, các sinh vật hoặc tế bào lưỡng bội có hai hệ gene, sinh vật đa bội có

nhiều hệ gene. Hệ gene của sinh vật Eukaryot bao gồm hệ gene nhân (genome

nhân), hệ gene ti thể (genome ti thể), hệ gene lục lạp (genome lục lạp). Hệ gene

ở Prokaryot chỉ có một thành phần gồm các đoạn ADN không giống nhau; còn

hệ gene ở Eukaryot có ba thành phần ADN không giống nhau: Các đoạn ADN

lặp lại nhiều (chiếm khoảng 25%), các đoạn ADN lặp lại ít (30%) và các đoạn

ADN không lặp lại (45%).

1.1. Hệ gene nhân

Hệ gene nhân là genome lớn nhất trong tế bào xét về mặt khối lượng cũng

như số lượng gene mã hoá. ADN nhân được sắp xếp gọn trong nhiễm sắc thể

trong sự liên kết với protein chứa histone và không chứa histone. ADN có vai

trò mã hoá thông tin di truyền, còn protein thì bảo vệ và tham gia điều khiển sự

sao chép, phiên mã được chính xác. Quá trình cơ bản trong phát triển động, thực

vật là sự nhân đôi vật chất di truyền và phân đều cho các tế bào con khi tế bào

phân chia. Tế bào thực vật chứa một lượng lớn ADN, khối lượng này thay đổi

theo loài. Arabidosis thaliana có lượng ADN nhỏ nhất (0.07 picogram). Allium

cepa có lượng ADN nhiều hơn 33,5 pg/ haploid genome (hệ gene đơn bội).

1.2. Hệ gene lục lạp

Cho đến năm 1962, người ta mới khám phá ra ADN và ribosom có trong

lục lạp. Như vậy, lục lạp hoặc trong lạp thể chứa tất cả bộ máy cần thiết để tự

mình biểu hiện hoạt động gene. Hệ gene lục lạp là toàn bộ các gene trong lục lạp

hay toàn bộ lượng thông tin di truyền chứa trong ADN của lục lạp.

Lượng ADN trong lục lạp rất lớn, chiếm tới 15% tổng lượng ADN cơ thể

thực vật, ribosom chiếm 60% lượng ribosom của tế bào, ADN lục lạp được cấu

tạo bởi các phân tử có cấu trúc mạch vòng, có trọng lượng phân tử 83 - 128 x

106

, trong đó gần 85% phân tử ADN là mạch đơn.

ADN lục lạp làm khuôn phiên mã tổng hợp mARN chloroplast. Ở đây các

phân tử mARN chỉ có khoảng 20 nucleotit, chúng thực hiện sự tổng hợp protein

tại chỗ trong chloroplast. Ribosom trong chloroplast là 70S bao gồm 30S và

50S. Sau khi tổng hợp xong protein được vận chuyển đến nơi mà lục lạp cần

thiết.

Về cơ bản hệ thống di truyền trong lục lạp tương tự với hệ thống di truyền

của sinh vật Prokaryot. Do vậy đã có nhiều cuộc tranh luận, có phải vật liệu di

truyền của sinh vật tiền nhân là nguồn gốc của ADN lục lạp? Ngoài ra ADN của

lục lạp không chứa một số gene đặc trưng cho những sinh vật có nhân thật. Điều

này đã tìm thấy trong ADN ở thuốc lá và ngô. Ribosom của lục lạp cũng giống

6

ribosom của sinh vật Procariot: 70S được cấu tạo bởi 2 tiểu phần 50S và 30S.

Ribosom của E. coli và lục lạp thực vật có đặc tính miễn dịch giống nhau.

Thông qua việc nghiên cứu sản phẩm biểu hiện gene là protein, người ta

đã phát hiện giữa hệ gene lục lạp và hệ gene nhân trong tế bào thực vật có mối

quan hệ chặt chẽ.

- Genome của lục lạp không có khả năng tổng hợp tất cả các protein có

trong chúng.

- Phần lớn polipeptid của lục lạp được tổng hợp do genome trong nhân tế

bào.

- Những polipeptid này được chuyển vào lục lạp theo cơ chế sau dịch mã

thực hiện qua vỏ lục lạp.

- Hệ thống di truyền lục lạp điều khiển tổng hợp các protein cần cho sự

phát triển của chúng với số lượng khoảng 100 polipeptid.

Bảng 1.1. Kích thước một số ADN lục lạp (ct. ADN), ADN nhân và vi khuẩn

AND Kích thước (bp) Kích thước vòng ( μ m)

Plasmid 1 ≈ 200 x 103 -

Trực khuẩn E-coli (chromosome) 3,8 x 106 -

Trùng roi (Euglena) (ct. ADN) 1,4 x 105 44 - 44

Thuốc lá (Tabaco) (ct. ADN) 1,6 x 105 -

Ngô (Maize) (ct. ADN) 1,36 x 105 43

Đậu xanh (mungbean) (ct. ADN) 1,21 x 105 39

- Polipeptid được mã hoá tổng hợp và ARN trong lục lạp đảm nhiệm chức

năng của cơ quan tử liên quan đến quá trình quang hợp. Ở lúa người ta đã xác

định được vị trí của các gene quan trọng điều khiển quá trình quang hợp như

rbcl, atpBE, pSbA, pstA, psbA. Các gene này đóng vai trò quan trọng trong quá

trình sinh tổng hợp protein ở hệ thống quang hoá II.

1.3. Hệ gene ti thể (Mitochondria Genome)

Để nghiên cứu hệ gene ti thể điều quan trọng đầu tiên là thu được ADN ti

thể. Có thể lấy ví dụ ở cây lúa theo Salech và cộng sự (1989), phương pháp phân

tích ADN trong ti thể gồm các bước sau:

- Li tâm với tốc độ chậm để loại bỏ nhân, lục lạp và các thành phần khác

của tế bào.

- Li tâm với tốc độ nhanh để tách ti thể.

- Li tâm với tốc độ chậm để lấy nhân, lục lạp và các thành phần khác.

7

- Xử lí ADN- ase I để phân giải các chất ADN nhân dính trong ti thể.

- Làm sạch ti thể.

- Tách chiết mtADN từ ti thể (mtADN).

Như vậy người ta có thể thu được ADN của mitochondria tinh sạch phục

vụ cho các công tác nghiên cứu tiếp theo.

mtADN thể hiện một sự khác biệt rất lớn về mặt kích thước và hình dạng.

Đối với động vật, mtADN có dạng vòng và kích thước xấp xỉ 15 - 20kb. Ngược

lại mtADN của thực vật có nhiều dạng (vòng.,thẳng vaà(cc dạng khác), cũng

như có kích thước lớn hơn nhiều: ở cây bắp cải là 200kb, hoặc ở một loại dưa là

2500 kb. Do vậy genome ti thể thực vật tương đối lớn và gồm một vài phân tử

ADN. Lượng mtADN trong thực vật chiếm khoảng 0,5 - 1% lượng ADN của tế

bào nhưng nó đóng vai trò sống còn cho sự phát triển và sinh sản thực vật.

Chức năng của mtADN giống như ctADN. Nó có khả năng mã hoóatổng

hợp một số lượng nhỏ pohlieptid nhưng rất quan trọng.,phục vụ cho những hoạt

động của chính nó.

Những sản phẩm chính mà mtADN điều khiển tổng hợp là 3 tiểu phần của

cytochromoxydaza, 2 tiểu phần của phức chất cytochrom bc và một số thành

phần khác (Andre, 1991). Ngoài ra mtADN còn đóng vai trò quan trọng trong

hiện tượng bất dục đực tế bào chất (CMS). Đây là một đặc tính được khai thác

trong sản xuất các dòng lai ở nhiều cây trồng như lúa, ngô... Spruill và cộng sự

(1981) đã chỉ ra ở cây ngô có sự khác nhau giữa mtADN trong tế bào cây

thường và trong tế bào cây có hiện tượng CMS. Khi phân tích sản phẩm protein

thì những mtADN ở cây CMS có khả năng tổng hợp chuỗi peptid 130000 MW,

nhưng nó mất khả năng tổng hợp chuỗi polipeptid 21000 MW ở nguyên sinh

chất tế bào cây bình thường.

Mặt khác người ta còn thấy hiện tượng bất dục tế bào chất còn liên quan

đến những phân tử ADN giống như plasmid tìm thấy trong ti thể.

Chẳng hạn ở ngô trong tế bào chất của cây CMS có mang hai phân tử

AND mạch thẳng với kích thước 6,2 kb và 5,2 kb. Việc sử dụng code mã hóa

tổng hợp protein của mtADN có những điểm cần lưu ý: trong hệ thống hoạt

động mã di truyền thông thường code UGA cung cấp tín hiệu kết thúc quá trình

tổng hợp một chuỗi polipeptid, nhưng ở ADN của ti thể nó lại là code của

tryptophan. Ngược lại ở ADN nhân code CGG mã hoá cho tryptophan thì ở ti

thể nó lại mã hoá arginin. Ngoài ra người ta đã phát hiện một dạng mới của

mARN trong genome ti thể cây trồng và nó được gọi là ARN - Editing. Đây là

một vấn đề thể hiện sự tiến hoá của thực vật bậc cao, giúp cho nó có khả năng

8

thích nghi hơn với điều kiện ngoại cảnh.

§2. AXIT NUCLEIC

2.1. Axit nucleic là vật chất di truyền

Axit nucleic bao gồm axit deoxyribonucleie (ADN) hoặc axit ribonucleic

(ARN) đều đáp ứng tiêu chuẩn của vật chất di truyền. Có rất nhiều bằng chứng

đã chứng tỏ ra axit nucleic là một vật chất di truyền ở cấp độ phân tử.

Axit nucleic hấp thụ tia tử ngoại cực đại ở bước sóng 260nm và điều này

phù hợp một cách chính xác với bước sóng mà tia tử ngoại có thể gây đột biến

tối đa ở tế bào, trong khi đó protein ở bước sóng 280nm.

- Năm 1928 F. Grifflth phát hiện thấy nòi phế cầu khuẩn S, khuẩn lạc

nhẵn do có vỏ bọc polisaccharid (vi khuẩn gây viêm phổi) của vi khuẩn

Diplococus pneumoniae làm chuột chết khi tiêm vào cơ thể chuột. Trong khi đó

khuẩn lạc R (khuẩn lạc không có vỏ bọc polisaccharid) không gây độc hại gì.

Hỗn hợp các phế cầu khuẩn R còn sống và phế cầu khuẩn S đã chết thì làm cho

chuột bị viêm phổi, chết và từ máu của chúng đã phân lập được vi khuẩn S sống.

Như vậy tác nhân nào đó từ phế cầu khuẩn đã biến nạp và làm cho phế

cầu khuẩn R thành S. Người ta đã chứng minh được rằng: ADN tách từ vi khuẩn

S nếu được đưa vào vi khuẩn R thì gây nên sự biến đổi kiểu R → S, phát hiện

này được khẳng định ADN là vật chất di truyền.

Năm 1944 O. T Avery, Mc Leod và Mc Carti đã chứng minh được rằng

tác nhân biến nạp là ADN. Phế cầu khuẩn S bị xử lí bằng protease hoặc ARN￾aza thì hoạt tính biến nạp vẫn còn: những nếu phế cầu khuẩn S bị xử lí bởi

ADN-aza thì hoạt tính biến nạp không còn nữa.

Hình 1.1. Sơ đồ chứng minh vật chất di truyền là ARN

Năm 1957, H. Fraen Kel - Conrat và B. Singer công bố thí nghiệm ở virut

đốm thuốc lá có lõi ARN và vỏ protein, có hai dạng a và b. Các thí nghiệm lắp

ráp lõi ARN của dạng này với protein của dạng kia và ngược lại đã thành công

tạo ra virut có vỏ và lõi thuộc hai dạng khác nhau. Sau đó đem gây nhiễm vào

9

thuốc lá, kết quả các virut con phân lập được từ vết đốm đều mang cả vỏ protein

và lõi ARN thuộc cùng một dạng là dạng của lõi ARN mang nhiễm chứ không

phải của vỏ protein. Như vậy thông tin di truyền được chứa đựng trong ARN

chứ không phải trong protein.

2.2. Axit nucleic ở virut, Prokaryot và Eukaryot

Virut là vật chất sống được cấu tạo rất đơn giản, gồm lõi là axit nucleic và

vỏ là protein. Vật chất di truyền của virut có hai loại: ADN và ARN. Đa số các

loài virut đều sống kí sinh, khi xâm nhập vào tế bào vật chủ (có thì toàn bộ virut

hay chỉ A. nucleic). Virut sống kí sinh ở tế bào Prokaryot được gọi là phage hay

bacteriophage (thực khuẩn thể). Một số virut có lõi là ARN chủ yếu kí sinh ở

thực vật, còn các virut kí sinh ở động vật và tế bào Prokarvot đa số có lõi là

ADN.

NST phải tạo ra môi trường vật lí để cho phân tử ADN hoạt động, tác

động qua lại với các hệ thống trao đổi chất trong tế bào. Hệ thống sắp xếp cách

tổ chức, bố trí ADN trong NST ở những tổ chức sinh vật chưa có nhân chính

thức và sinh vật nhân chuẩn có sự khác nhau như thế nào? Người ta đã sử dụng

ba hướng chính để nghiên cứu tổ chức ADN trong các đối tượng sinh vật khác

nhau, đó là việc sử dụng các thiết bị và kĩ thuật như kính hiển vi điện tử, nhiễu

xạ tia X, xử lí bởi enzyme biến đổi cấu trúc NST.

Đối với sinh vật Prokaryot, tổ chức ADN trong NST ở dạng nucleoid

(vùng nhân). Vùng nhân chứa ADN và ADN được gấp và cuộn thành nhiều

vòng xoắn: ADN ở dạng siêu xoắn, tính chất siêu xoắn chịu sự kiểm soát của

enzyme topoisomerase. Ví dụ ở E. coli ADN có kích thước 300 μ m khi co ngắn

kích thước dài 25 μ m và tiếp tục co ngắn thì kích thước chỉ còn 1,5 μ m. Cách

sắp xếp này được phát hiện nhờ enzyme ribonuclease và deoxyribonuclease.

Prokaryot chứa ADN trần, chuỗi kép, dạng vòng, ngoài ra vật chất di truyền còn

ở plasmid (chiếm l-2%). E. coli chỉ có 1 phân tử ADN dạng vòng chứa 3000-

4000 gene.

Đối với sinh vật Eukaryot, ADN trong tế bào có cả trong nhân, ti thể và

lạp thể và chủ yếu ADN nằm trên nhiễm sắc thể trong nhân tế bào. ADN nhân

có dạng mạch kép, chủ yếu là B-ADN. ADN ti thể và ADN lục lạp có dạng kép

vòng. Tổ chức ADN trong nhiễm sắc thể ở dạng nucleosome (thể nhân). Mỗi

nucleosome gồm phân tử ADN và protein (kiềm) được gọi histon. Histon gồm 8

phân tử (octamer). Phân biệt 5 loại histon với tỉ lệ gần như nhau H1, H2A, H2B,

H3, H4. Trong đó có 2 phân tử H3, 2 phân tử H4 liên kết với ở vùng trung tâm;

2 phân tử H2A, 2 phân tử H2B liên kết ở vùng ngoài.

10

Các nucleosome nối với nhau bằng một đoạn nucleotit (ADN) dài 15 -

100 cặp nucleotit. NST có cấu trúc xoắn theo nhiều bậc: tập hợp nhiều

nucleosome thành sợi cơ bản có cấu trúc xoắn (100Å), sợi cơ bản tiếp tục xoắn

thành solenoit (sợi nhiễm sắc) có đường kính là: 250Å: solenoit cuộn xoắn lần

nữa tạo nên ống rỗng có đường kính 2000Å; ống rỗng này cuộn xoắn một lần

nữa thành sợi chromatit có đường kính bằng 6000Å.

§3. ADN VÀ TÁI BẢN ADN

3.1. Đặc điểm cấu trúc của phân tử ADN

Hàm lượng ADN trong nhân tế bào đặc trưng cho từng loài và phụ thuộc

và số lượng nhiễm sắc thể trong nhân. ADN là đại phân tử, có khối lượng và

chiều dài rất lớn. Ở sinh vật Prokaryot mỗi nhiễm sắc thể có thểcó nhiều phân tử

ADN, còn ở sinh vật Eukaryt mỗi nhiễm sắc thể chỉ có một phân tử ADN.

Bảng 1.2. Hàm lượng ADN của một số loài sinh vật

Người

Ruồi giấm

Tế bào lưỡng bội (2n)

6,6 pg ADN

2 pg ADN

Tế bào đơn bội (n)

3,3 pg ADN.

1 pg ADN.

1 picogram (pg) ADN = 0,965. 109

bp = 6,1.1011 dalton = 29cm

Người ta đã phân biệt các dạng ADN là B, A. Z, C, D. Các dạng AND

khác nhau bởi chiều xoắn, chiều cao một chu kì xoắn, số cặp nucleotit trong một

chu kì.

11

Bảng 1.3. So sánh đặc điểm của một số loại AND

Dạng

AND

Chiều

xoắn

Số cặp

nucleotit

chu kì

Góc xoắn

(

0

)

Đường

kính

(Å)

Chiều cao

một chu kì

xoắn

Dạng

thiết điện

B Phải 10 36 20 34 Tròn

A Phải 11 32,7 23 28 Tròn

Z Trái 12 30 18 37,1 zigzac

C Phải 9,3 38,6 20 31 Tròn

D Phải 8 - - - Bát giác

Oatsơn và Cric (1953) đã xây dựng mô hình B-ADN (phổ biến nhất), đó

là chuỗi xoắn kép gồm 2 mạch polinucleotit xoắn theo chiều từ trái sang phải.

Mô hình của Oatsơn và Crick đã lí giải được những chức năng cơ bản của ADN

là bảo đảm cho việc tái sinh trong quá trình tự sao chép ở gian kì và điều chỉnh

việc tổng hợp các enzyme và các protein. Đây là mốc thời gian đánh dấu sự ra

đời của ngành sinh học phân tử.

ADN và ARN đều là những polime gồm nhiều monomer nối với nhau,

mỗi monomer gọi là nucleotit (ở ADN gọi là deoxynucleotit, còn ở ARN là

ribonucleotit). Mỗi deoxynucleotit và ribonucleotit gồm 3 thành phần bazơ nitơ (

purin và pirimidin) đường pentose và axit photphoric.

Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo phân tử đường deoxyribose và ribose

Các bazơ purin (kích thước khoảng 7Å) gồm Adeine (A); Guanine (G);

còn các bazơ pirimidin (kích thước khoảng 5Å) gồm Thymine (T); Cytosine (C);

Uracil (U).

12

Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc của các loại bazơ nitơ

Hình 1.4. Sơ đồ cấu tạo các deoxynucleotit

Kết quả nghiên cứu của Chargaff về phân tích hàm lượng bazơ purin và

pirimidin trong ADN thấy rằng tỉ lệ Adenine bằng Thymine và tỉ lệ Guanine

bằng Cytosine (A = T; G = C).

ADN gồm hai chuỗi polinucleotil, mỗi mạch polinucleotit có nhiều

nucleotit liên kết với nhau bằng mối liên kết phosphodieste. Các bazơ đối diện

trên hai mạch đơn liên kết với nhau bằng mối liên kết hydro theo nguyên tắc bổ

sung (A - T; G - C). Hai mạch polinucleotit của ADN có chiều ngược nhau:

13

3'OH ⎯⎯→ 5'P

5'P ⎯⎯→ 3'OH

Tính đặc trưng của phân tử ADN phụ thuộc vào 3 yếu tố: số lượng, thành

phần và trình tự sắp xếp các nucleotit trong ADN, trong đó phụ thuộc nghiêm

ngặt vào trình tự các nucleotit.

Kích thước của phân tử ADN được tính bằng bp (base pair- cặp bazơ)

hoặc kb (kilobase - kb = 1000 bp), vì tính đặc hiệu của nucleotit là do bazơ, cho

nên khi nói đến axit nucleic thì bazơ thường được dùng thay cho nucleotit.

Hình 1.5. Sơ đồ chuỗi polinucleotit của B-ADN

3.2. Tái bản ADN

3.2.1. Các kiểu tái bản ADN

Người ta đưa ra 3 giả thuyết về các kiểu tái bản ADN:

Kiểu bảo toàn: Chuỗi ADN mẹ giữ nguyên, ADN mới được tổng hợp từ

nguyên liệu (chưa có bằng chứng trong tự nhiên).

Kiểu phân tán: ADN ban đầu đứt ra từng đoạn nhỏ, mỗi đoạn nhỏ làm

khuôn để tổng hợp các đoạn nhỏ khác. Các đoạn nhỏ nối lại với nhau thành

ADN.

Kiểu bán bảo tồn: Meselson và Stahl chứng minh 1958 ở E. coli sử dụng

đồng vị phóng xạ N15.

Mathew Meselson và Franklin Stahl (Mỹ - California) tiến hành thí

nghiệm nuôi E. Coli với nguồn N15, đã chứng minh được cơ chế tái bản ADN.

3.2.2. Hệ enzyme tái bản ADN

14

• Ba loại enzyme ADN-polimerase ở E. Coli

- ADN-poIimerase I: giữ vai trò trong tái bản ADN, có thể dễ sửa chữa.

- ADN-poIimerase II: xác định sự bắt đầu tổng hợp ADN.

- ADN-poIimerase III: điều khiển tổng hợp ADN, thực hiện nhiệm vụ chủ

yếu gia tăng chiều dài của một sợi mới.

• Ba loại enzyme ADN - polimerase ở Eukaryot

- ADN-polimerase (120.000 - 300.000 dalton) có chức năng tái bản

ADN của nhân.

α

- ADN-polimerase β (30.000 - 50.000 dalton) sửa đổi ADN.

- ADN-polimerase γ (150.000 - 300.000 dalton) tái bản hệ gene ti thể.

3.2.3. Cơ chế tái bản ADN theo Okazaki -Tái bản nửa gián đoạn

(Semidiscontinous replication )

3.2.3.1. Hiện tượng duỗi xoắn

Hiện tượng trên có sự tham gia của một loại protein là SSB (Single Strand

Binding) bám vào sợi đơn ADN luôn ở trạng thái mở xoắn, mỗi SSB bám vào 8

bazơ và mỗi chạc tái bản có 250 SSB.

3.2.3.2. Khởi đầu tái bản bằng ARN mồi (primer)

ARN polimerase hoạt động tổng hợp đoạn ARN mồi ngắn tạo ra đầu

3'OH tự do, sau đó ADN polimerase III hoạt động tái bản. Đối với E. coli primer

được tạo ra bởi enzyme primase.

3.2.3.3. Kéo dài, loại bỏ mồi và hình thành các phân đoạn Okazaki

Sau khi ARN mồi được tổng hợp, thì ADN-polimerase I hoạt động loại

bỏ mồi nhờ cắt từ (5' - 3') và thay vào đó là một đoạn ADN mới (hình thành

phân đoạn Okazaki). Mỗi phân đoạn Okazaki có 1000 - 2500 bazơ. Các phân

đoạn Okazaki nối với nhau bằng ADN-ligase. Sợi ADN mới được tổng hợp

bằng cách nối các phân đoạn okazaki được gọi là sợi ra chậm (lagging strand) là

sợi được tổng hợp không liên tục (gián đoạn); sợi kia được tổng hợp liên tục trên

khuôn của sợi ADN có chiều 3' - 5'. Cơ chế tái bản ADN có một sợi được tổng

hợp liên tục và một sợi được tổng hợp gián đoạn được gọi là tái bản nửa gián

đoạn.

- Mạch ADN mới được tổng hợp theo chiều 5' - 3', một mạch polinucleotit

được tổng hợp liên tục và một mạch được tổng hợp gián đoạn- Mỗi bước của

15