Chức năng của miR-3085 trong thoái hóa khớp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

CHỨC NĂNG CỦA MIR-3085 TRONG THOÁI HÓA KHỚP

Mã số: E.2018.01.1

TP.HCM, tháng 6 năm 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

CHỨC NĂNG CỦA MIR-3085 TRONG THOÁI HÓA KHỚP

Mã số: E.2018.01.1

Xác nhận của tổ chức chủ trì Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ tên, đóng dấu) (ký, họ tên)

Lê Thị Trúc Linh

TP.HCM, tháng 6 năm 2022

DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ

ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH

1. NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI

Họ và tên Đơn vị công tác và lĩnh vực

chuyên môn

Nội dung nghiên cứu cụ thể

được giao

Hồ Thị Bích Phượng Khoa CNSH- Đại học Mở TP.

HCM

Thực hiện phần sinh học

phân tử

2. ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH

Tên đơn vị trong và

ngoài nước

Nội dung phối hợp nghiên

cứu

Họ và tên người đại diện

đơn vị

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH............................................................................................................1

DANH MỤC BẢNG...........................................................................................................3

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................................................................4

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS ..............................................................6

PHẦN I. PHẦN MỞ ĐẦU.................................................................................................8

1.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu (trong và ngoài nước) .........................................9

1.1.1. Bệnh thoái hóa khớp...............................................................................................9

Giải phẫu bệnh ..............................................................................................................9

Nguyên nhân gây bệnh..................................................................................................9

Cơ chế bệnh sinh thoái hoá khớp ................................................................................10

Chẩn đoán....................................................................................................................12

Các xét nghiệm khác ...................................................................................................13

Điều trị THK ...............................................................................................................13

Dịch tễ học ..................................................................................................................14

1.1.2. MicroRNA...............................................................................................................15

Tình hình nghiên cứu quan hệ giữa miRNA và THK.................................................17

1.1.3. Hiện trạng các công trình nghiên cứu liên quan đến nhiệm vụ .............18

Các công trình ngoài nước.......................................................................................18

Các công trình trong nước .......................................................................................23

1.2. Lý do nghiên cứu và tính cấp thiết của đề tài.........................................................23

PHẦN 2. MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................................................25

2.1. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................26

2.2. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................................26

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................26

2.2.2. Phạm vi nghiên cứu................................................................................................26

2.3. Cách tiếp cận .............................................................................................................27

2.4. Phương pháp nghiên cứu .........................................................................................27

2.4.1. Trang thiết bị sử dụng ...........................................................................................27

2.4.2. Vật tư sử dụng ........................................................................................................28

Môi trường ..................................................................................................................28

Vật liệu sinh học..........................................................................................................29

2.4.3. Dự đoán gen mục tiêu của miR-3085 bằng phần mềm tin-sinh học..................29

2.4.4. Đánh giá tương tác của miR-3085 lên gen đích tiềm năng.................................29

Chuyển gen vào tế bào SW1353 .................................................................................29

Tách chiết RNA và kiểm tra mức độ biểu hiện của gen đích trong tế bào SW1353 ..31

Thống kê phân tích số liệu ..........................................................................................33

2.4.5. Chứng minh gen đích của miR-144-3p ................................................................33

Phản ứng tạo dòng vùng 3’UTR có chứa trình tự nhận biết của gen đích ............33

Chuyển gen vào tế bào SW1353 .................................................................................36

Thử nghiệm Lusiferase ...............................................................................................36

Thống kê số liệu ..........................................................................................................40

PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..................................................41

3.1. Dự đoán gen đích của miR-3085-3p ........................................................................42

3.1.1. Vị trí di truyền của miR-3085-3p .........................................................................42

3.1.2. Một số đích tiềm năng của miR-3085-3p.............................................................42

3.2. Ảnh hưởng của miRNA-3085 đối với sự biểu hiện của gen đích trong tế bào ....46

3.3. Chứng minh thực nghiệm một số gen là đích trực tiếp của miR-3085-3p .........49

3.3.1. Thu nhận vector pmirGLO...................................................................................49

3.3.2. Thu nhận vùng 3’UTR của gen TNFRSF19 và SCIN.........................................50

3.3.3. Biến nạp sản phẩm ghép nối vào vi khuẩn Ecoli và kiểm tra sản phẩm ghép.52

3.3.4. Thử nghiệm Luciferase kiểm tra khả năng gắn vào vị trí seed site trên vùng

3’UTR của các gen đích của miR-3085-3p ....................................................................53

Thử nghiệm Luciferase kiểm tra khả năng gắn vào vị trí seed site trên vùng 3’UTR

wide type của các gen đích của miR-3085-3p ............................................................53

Thử nghiệm Luciferase kiểm tra khả năng gắn vào vị trí seed site trên vùng 3’UTR đột

biến của gen đích SCINcủa miR-3085-3p ..................................................................55

Thảo luận.....................................................................................................................57

PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................................68

4.1. Kết luận......................................................................................................................69

4.2. Kiến nghị....................................................................................................................69

TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................................70

1

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Mô hình sinh lý bệnh của thoái hóa khớp gối.......................................................10

Hình 2. Sự mất cân bằng tạo điều kiện cho sự thoái hóa ở khớp gối ................................11

Hình 3. Các kiểu bắt cặp của miRNA và mRNA mục tiêu ...............................................16

Hình 4. Sự bắt cặp ở đầu 3’ miRNA (màu cam) và 3'UTR mRNA (xanh lá)...................16

Hình 5. MiR-3085 là microRNA .......................................................................................19

Hình 6. MiR-3085 điều hòa giảm biểu hiện của collagen typ II và aggrecan ...................20

Hình 7. IL-1 tăng biểu hiện miR-3085 dẫn đến ức chế con đường tín hiệu NFkB ...........21

Hình 8. TGFβ gia tăng miR-3085 dẫn đến ức chế con đường tín hiệu Smad ...................22

Hình 9. MicroRNA 3085 điều hòa con đường truyền tín hiệu Wnt3a/ b-catenin .............23

Hình 10. Công thức DOTMA ............................................................................................30

Hình 11. Công thức của DOPE..........................................................................................30

Hình 12. Chuyển gen vào tế bào dựa trên cation liposome (Parker et al., 2003; Scientific,

2017) ..................................................................................................................................31

Hình 13. Phản ứng sinh hóa xúc tác bởi Firefly luciferase tạo ra sự phát quang ..............37

Hình 14. Phản ứng sinh hóa xúc tác bởi Renilla luciferase tạo ra sự phát quang..............37

Hình 15. Nguyên tắc của hệ thống thử nghiệm Luciferase................................................38

Hình 16. Trình tự nucleotide của tiền miR-3085...............................................................42

Hình 17. Vị trí seed site của miR-3085-3p trên vùng trình tự 3’UTR của TNFRSF19 ...45

Hình 18. Bốn vị trí nhận biết của miR-3085-3p được tìm thấy trên vùng 3’UTR của SCIN

............................................................................................................................................46

Hình 19. Phân tích Realtime RT-PCR về mức độ biểu hiện của TNFRSF19 trong tế bào

SW1353 được chuyển với miR-3085-3p mimic trong 48 giờ (n=3).................................47

2

Hình 20. Phân tích Realtime RT-PCR về mức độ biểu hiện của TNFRSF19 trong tế bào

SW1353 được chuyển chất ức chế miR-3085-3p trong 48 giờ.........................................48

Hình 21. Mức độ biểu hiện của SCIN bị ức chế của miR-3085-3p ...................................49

Hình 22. Kết quả điện di sản phẩm pmirGLO chưa cắt và đã cắt với enzyme XhoI .......50

Hình 23. Kết quả điện di sản phẩm PCR của đoạn gen TNFRSF19 trên agarose ............51

Hình 24. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng 3’UTR của đoạn gen SCIN trên agarose .52

Hình 25. miR-3085-3p ức chế biểu hiện của enzyme luciferase trong pmirGLO-3’UTR

SCIN...................................................................................................................................54

Hình 26. miR-3085-3p ức chế biểu hiện của enzyme luciferase trong pmirGLO-3’UTR

TNFRSF19 .........................................................................................................................55

Hình 27. MicroRNA 3085-3p không có tác động lên hoạt tính luciferase của vector

pmirGLO-SCIN 3’UTR mutant .........................................................................................56

3

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ................................................................32

Bảng 2. Trình tự mồi cho phản ứng Real-time RT-PCR...................................................32

Bảng 3. Thành phần Realtime PCR...................................................................................33

Bảng 4. Trình tự mồi khuếch đại Clonning cho gen đích TNFRSF19 và SCIN................33

Bảng 5. Thành phần phản ứng PCR trong nghiên cứu ......................................................34

Bảng 6. Thành phần phản ứng cắt bằng Enzyme XhoI.....................................................35

Bảng 7. Thành phần phản ứng nối vector và insert...........................................................35

Bảng 8. Thành phần Lysis buffer.......................................................................................39

Bảng 9. Thành phần Stop & Glo........................................................................................39

Bảng 10. Thông tin miR-3085 ...........................................................................................42

Bảng 11. Một số gen đích tiềm năng thuộc một số con đường truyền tín hiệu quan trọng là

đích của miR-3085-3p........................................................................................................43

Bảng 12. Mức độ biểu hiện của một số gen đích tiềm năng của miR-3085-3p ...............44