Bài 12 Phân loại vi sinh bằng Sinh Học Phân Tử

Bài 12 Phân loại vi sinh bằng Sinh Học Phân Tử

1. Khái quát về các phương pháp phân loại vi sinh vật

truyền thống:

Trước đây công tác phân loại vi sinh vật vẫn dựa căn bản trên các đặc tính

hình thái, sinh lý và hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào khuẩn lạc, khả

năng di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả năng sinh acid trong môi trường cũng

như sắc tố tạo thành v.v..Các đặc trưng này đôi khi cũng bộc lộ những hạn chế

do các đặc tính được dùng cho nhóm vi sinh vật này (Enterobacteriaceae) nhưng

lại không có ý nghĩa đối với nhóm khác (vi khuẩn gram âm - gram negative

bacteria). Hạn chế của các phương pháp phân loại truyền thống dẫn đến nhiều

trường hợp phải xác định lại tên phân loại của một số vi sinh vật. Từ trước đến

nay, đơn vị cơ bản của định tên vi sinh vật là loài, bao gồm nhóm các cơ thể có

mức độ tương đồng cao về các đặc điểm hình thái.

Các phương pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa:

Từ những hạn chế của việc xác định các đặc tính hình thái dẫn đến nhiều

nghiên cứu tập trung vào các phản ứng sinh hóa đặc trưng cho các vi sinh vật

riêng biệt. Sự khác biệt của các phản ứng có ý nghĩa cho phân loại các vi sinh

vật.

- API20E KIT,

nguyên tắc: dựa vào 20 phản ứng khác nhau. Nói chung hiện nay có nhiều

nơi vẫn dùng kỹ thuật này nhưng nhìn chung kết quả cũng còn nhiều sai

số do nhiều nguyên nhân khác nhau: cụ thể trong các trường hợp gene

quyết định phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mất do nhiều

nguyên nhân khác nhau như tuổi tế bào, lượng giống cấy hay thay đổi

trong quá trình nuôi cấy dẫn đến sai khác và làm sai kết quả.

- Phân biệt bằng thực khuẩn thể:

Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau. Có thực khuẩn

thể xâm nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể

nhân lên thành các hạt trong tế bào chủ, trong khi đó với một số vi

khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễm nhưng lại không làm tan tế bào vi

khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật chủ. Dựa vào sự khác biệt

này mà người ta dùng các thực khuẩn thể khác nhau để phân biệt các

đối tượng vi khuẩn nghiên cứu.

Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm khó giải

quyết là các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay

đổi do điều kiện ngoại cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm

khác nhau đối với các thực khuẩn thể khác nhau. Mặt khác nữa, thực

khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do đó cũng làm thay đổi cơ chế

xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ.

- Phân biệt theo Typ huyết thanh:

Đây là phương pháp được dùng khá lâu nhưng rất hiệu quả và hiện vẫn

đang được sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt). Nguyên tắc là dựa vào

nhóm quyết định kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên

mao hoặc protein vỏ). Ưu thế của phương pháp này là các kháng huyết

thanh được dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiều trường hợp

đặc trưng cho loài. Nói chung đây là phương pháp khá ổn định nhưng hạn

chế chủ yếu của phương pháp này ở chỗ: yêu cầu kỹ thuật sản xuất

kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh không

đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặp lại.

- Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn

(Bacteriocin):

Bacteriocin bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống

lại vi khuẩn khác. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có

khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã

được phân loại dựa vào kiểu bacteriocin.

Kết luận: Có nhiều phương pháp truyền thống được sử dụng trong nhiều

nghiên cứu phân loại nhưng không có phương pháp nào tỏ ra vạn năng thích

hợp cho mọi đối tượng vi sinh vật, tính chính xác chỉ có thể đạt được khi kết

hợp nhiều phương pháp khác nhau.

2. Cách tiếp cận phân loại học với kỹ thuật sinh học

phân tử:

Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng

dụng hữu hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật. Nếu như

các phương pháp truyền thống chỉ tập trung trên một số đối tượng vi sinh vật

thì phương pháp sinh học phân tử có thể áp dụng trên mọi đối tượng vi sinh vật.

Nói chung các phương pháp sinh học phân tử tập trung vào các kỹ thuật

chủ yếu là:

+ Phân tích acid nucleic.

+ Phân tích protein.

+ Phân tích lipopolysaccharid.

+ Hóa phân loại học.

Trong phần này chúng tôi tập trung giới thiệu một số kỹ thuật phân loại

liên quan đến acid nucleic. Các phần sau chúng tôi lần lượt giới thiệu các

phương pháp liên quan đến polysaccharid, lipoprotein và hóa phân loại.

2.1. Phân tích acid nucleic:

Kỹ thuật phân tích acid nucleic liên quan chủ yếu đến phân tích kích

thước, cấu trúc acid nucleic, mối tương quan về trình tự acid nucleic thông qua

giải trình tự ADN và lai ADN.

a. Phân tích ADN plasmid:

Phương pháp phân tích ở đây bao gồm tách plasmid, so sánh các loại

plasmid về kích thước sau đó tinh sạch plasmid và xử lý bằng enzym cắt hạn

chế, sau đó điện di trên gel agarose và so sánh sự đa hình của các mảnh cắt để

phân biệt các chủng vi sinh vật với nhau.

Plasmid vòng

Streptomyces và Borrelia

Plasmid là nhân tố di truyền ngoài nhân và sao chép độc lập với nhiễm sắc

thể. Cấu trúc plasmid là sợi đôi ADN khép kín theo vòng. Tuy nhiên, có nhiều

trường hợp ngoại lệ là sợi kép ADN mạch thẳng (đối với vi khuẩn Borrelia và

Streptomyces). Plasmid được tìm thấy hầu hết ở các vi khuẩn và một số ít các vi

sinh vật nhân thực bậc thấp như nấm men.

+ Tách plasmid:

Thông thường lượng plasmid có trong tế bào chiếm < 5% tổng số acid nucleic

của tế bào. Như vậy, ta phải thực hiện phép tách plasmid ra khỏi ADN của

nhiễm sắc thể. Nói chung có nhiều phương pháp tách plasmid từ vi khuẩn nhưng

nguyên tắc chung là phá tế bào vi khuẩn dùng enzym, siêu âm hay trong dung

dịch kiềm có chất tẩy rửa là SDS hoặc TritonX-100, sau đó là việc loại ADN của

nhiễm sắc thể và protein. Thông thường dùng phương pháp kết tủa với axetat.

Lúc này phần lớn các thành phần ADN nhiễm sắc thể và protein của tế bào đã bị

kết tủa bị loại bằng li tâm và plasmid nằm trong dịch trên tủa được tách khi kết

tủa với ethanol hay isopropanol. Đây là phương pháp có hiệu quả để tách

plasmid, trên thực tế hiệu quả tách các plasmid có kích thước nhỏ cao hơn nhiều

so với các plasmid có kích thước lớn (>100 Kb). Với các plasmid có kích thước

lớn cần các thao tác nhẹ nhàng để tránh đứt gãy do các nguyên nhân cơ học.

Với cách tách plasmid như trên thì sản phẩm thu được có lẫn các đoạn ADN có

kích thước khoảng 500 bp và nhiễm ARN. Để tránh nhiễm ARN thì cần xử lý với

RNase (ribonuclease A). Tuy nhiên, có thể tách theo các phương pháp như:

- Tách bằng Caeseium chloride.

- Tách bằng KIT QIAGENE.

- Tách bằng kỹ thuật khác.

+ Điện di plasmid trên gel agarose:

Sau khi thu được plasmid thì phải tiến hành kiểm tra trước khi phân tích

kết quả điện di trên gel agarose để biết phổ plasmid và kích thước của chúng.

Khi tiến hành điện di thì nồng độ gel khoảng 0.7- 1% với một trong các đệm

sau: TAE (40 mM Tris acetat 1mM EDTA, pH 8.0), TBE (89 mM Tris borat 89 mM

boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.0) và TPE (80 mM Tris- phosphats 2 mM EDTA, pH

8.0). Sau khi điện di, gel được nhuộm với ethidium bromide và phát hiện dưới

tia UV (310 nm). Nồng độ ethidium bromide khoảng 5 mg/l và thời gian nhuộm

là 10 phút. Sau đó được rửa một lần nhanh bằng nước loại ion trước khi được

nhìn dưới UV và chụp ảnh làm tài liệu.

Một số vấn đề cần lưu ý khi phân tích plasmid: trên gel thông thường

plasmid được thấy ở 3 dạng: dạng siêu xoắn, dạng đứt gãy và dạng mạch thẳng

khi bị cắt bởi endonuclease. Dạng di chuyển tốc độ cao hơn là siêu xoắn (Hình

1.1).

Hình 1.1. Di chuyển của plasmid mạch thẳng (L) và siêu xoắn (OC) khi điện di

Đôi khi việc tách plasmid cũng phức tạp đặc biệt trong những trường hợp

plasmid có kích thước nhỏ có lẫn các mảnh ADN của nhiễm sắc thể. Trong mọi

trường hợp đều có nhiễm các RNA và chúng di động nhanh nhất trừ các trường

hợp plasmid như vậy không được nhầm lẫn giữa plasmid siêu xoắn và dạng

chính plasmid đứt gãy và plasmid khác. Một chú ý khác là tránh nhầm lẫn khi so

sánh kích thước giữa các plasmid siêu xoắn và dạng duỗi xoắn hay mạch thẳng.

Thực tế là chỉ có thể so sánh các plasmid siêu soắn với nhau về kích thước.

Khi tiến hành phân biệt giữa các chủng vi khuẩn thì đương nhiên là chỉ có

thể thực hiện so sánh giữa các chủng cùng có plasmid với nhau. Cũng nên chú ý

là không phải các chủng đều giống nhau về đặc tính miễn dịch nếu có chung kết

quả phân tích plasmid như nhau. Phép phân tích sẽ có hiệu quả trong các mẫu

có nhiều loại plasmid, tuy nhiên cũng phải tính đến việc các plasmid cũng có thể

bị mất trong quá trình bảo quản.

+ Kỹ thuật dấu vân tay (finger printing) phân tích

plasmid với enzym cắt hạn chế:

Cho đến nay, người ta đã tìm thấy hơn 400 enzym cắt hạn chế. Mục đích

của kỹ thuật này bổ sung cho kỹ thuật so sánh phổ kích thước plasmid ở trên.

Tức là người ta có thể phân biệt được sự khác nhau của các plasmid có cùng

kích thước. Như vậy, khi xử lý plasmid với một hay kết hợp một số enzym cắt

hạn chế thì kết quả sẽ thu được là các đoạn ADN được cắt có kích thước khác

nhau. Kết quả này có độ lặp lại cao, do đó dễ sử dụng khi so sánh các mẫu khác

nhau.

Hiện nay, có nhiều enzym cắt hạn chế được sản xuất và tiêu thụ trên thị

trường, các enzym này có điểm nhận biết thay đổi từ 4-6 cặp nucleotid. Thông

thường xử lý enzym trong 1 giờ sau đó mẫu được phát hiện trên gel agarose